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Sintesi di molecole biologicamente attive con tecniche chemoenzimatiche

La chimica sintetica per sua stessa definizione (sintesi = processo di mettere insieme) è la scienza di costruire molecole a partire da atomi e/o molecole. Può essere suddivisa in chimica organica sintetica e chimica inorganica sintetica, in funzione della natura delle molecole target. La sintesi infine può essere definita a sua volta “totale” quando ci si pone l’obiettivo di sintetizzare una molecola, spesso complessa, a partire da semplici elementi. Nel corso degli anni la disciplina si è affermata soprattutto per l’ottenimento di molecole bioattive e/o naturali (ma non solo), portando ad un impatto considerevole in campo medico e farmacologico. La sintesi organica quindi è ora come ora una scienza che si pone l’obiettivo di costruire molecole complesse per i più svariati utilizzi.

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Tesi di Dottorato di Ricerca in Scienze Chimiche, Bologna 2013

Pubblicato
da Martina Gambini
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Settori: 


Estratto del testo
1
Alma Mater Studiorum '' Università di Bologna
DOTTORATO DI RICERCA IN Scienze Chimiche
Ciclo XXV Settore Concorsuale di afferenza: 03/C1

Settore Scientifico disciplinare: CHIM/06
Sintesi di molecole biologicamente attive con tecniche chemoenzimatiche:
-lattami, profeni e - amminoacidi non naturali

Presentata da: Matteo Pori



Coordinatore Dottorato
Relatore

Adriana Bigi
Daria Giacomini








Esame finale anno 2013 2
Indice
1. MEDAGLIONE 3 2. ABSTRACT 4 3. INTRODUZIONE La sintesi organica: storia e recenti sviluppi 5 La biocatalisi 7 La sintesi organica per la costuzione di molecole biologicamente attive 10 Le classi di molecole sintetizzate durante il mio dottorato 12
1) I -LATTAMI 1.1 Struttura chimica dei 'lattami 15
1.2 L''anello 'lattamico nelle molecole biologicamente attive: antibiotici 16 1.3 L''anello 'lattamico nelle molecole biologicamente attive: inibitore 45
enzimatico e altre attività
1.4 L''anello 'lattamico come sintone: sintesi di 'amminoacidi 53 1.5 Parte sperimentale 62
2) I PROFENI
2.1 Gli acidi 2-Aril Propionici 82 2.2 Metodologie di sintesi di (S)-Profeni 84 2.3 Metodo chemoenzimatico per la sintesi di (S)-Profeni con Alcol 90
Deidrogenasi , 2.4 Metodo chemoenzimatico per la sintesi di (S)-Profeni con Alcol 118
Deidrogenasi: Ossidazione
2.5 Parte Sperimentale 138
3) Gli
-amminonitrili 3.1 -amminonitrili : reattività e sintesi 145 3.2 La sintesi di Strecker degli -amminonitrili 149 3.3 La sintesi di Strecker asimmetrica , 160 3.4 Parte sperimentale 171






3
Medaglione

Abstract (inglese)
4
The research project of this thesis has been focused on the synthesis of three class of molecules: β-lactams,
Profens and α-aminonitriles by using modern techniques of organic synthesis, favouring sustainable and
green methodologies, especially biocatalytic strategies.
Profens are a very important and widespread category of pain killer and in particular we developed and
optimized a two steps procedure to obtain (S)-Profens from racemic 2-aryl propanals. The first step was a
bioreduction of the aldehydes to (S)-2-Aryl Propanols with a DKR process mediated by Horse Liver Alcohol
Dehydrogenase (HLADH); the second one was a ''green oxidation' to (S)-Profens promoted by NaClO2 and
TEMPO/NaClO as catalyst. To improve the whole two-step process, in a collaboration with the research
group of Francesca Paradisi at the University College of Dublin we immobilized a modified HLADH, with
good yields and better enantioselectivity. We also proposed an interesting enzymatic approach for the
oxidation of (S)-2-Aryl Propanols by using Laccase from Trametes Versicolor.
β-lactam ring is a very important heterocycle, known to be an interesting pharmacophore. We synthesized
new N-methylthio monobactams which showed an interesting antibacterial activity against resistant strains
of Staphilococcus Aureus collected from patients of cystic fibrosis. We then conjugated polyphenolic groups
to the new monobactams obtaining molecules with antioxidant and antibacterial with dual-activity. A new
hybrid retinoid-β-lactam was developed which induced differentiation on neuroblastoma cells. The ring
opening of monobactams by hydrolytic enzymes was investigated to access desymmetrizated chiral β-
aminoacids such as beta-aminoglutamic acid monoesters.
For what concerns the third class of molecules reported, the α-aminonitriles, a new Strecker protocol was
developed. Reactions worked very well in water by using acetone cyanohydrin as cyanide source with
different aldehydes and ketones and primary or secondary amines; to provide an asymmetric version of our
protocol we used chiral amines from chiral pool obtaining new chiral α-aminonitriles.

Abstract (italiano)
Il progetto di ricerca di questa tesi è stato focalizzato sulla sintesi di tre classi di molecole: β-lattami, Profeni
e α-amminonitrili, utilizzando moderne tecniche di sintesi organica, metodologie ecosostenibili e strategie
biocatalitiche.
I profeni sono una categoria di antiinfiammatori molto diffusa e in particolare abbiamo sviluppato e
ottimizzato una procedura in due step per ottenere (S)-Profeni da 2-arilpropanali raceme. Il primo step
consiste in una bioriduzione delle aldeidi per dare i relativi (S)-2-Aril Propanoli tramite un processo DKR
mediato dall''enzima Horse Liver Alcohol Dehydrogenase. Il secondo, l''ossidazione a (S)-Profeni, è promossa
da NaClO2 e TEMPO come catalizzatore. Con lo scopo di migliorare il processo, in collaborazione con il
gruppo di ricerca di Francesca Paradisi all''University College Dublino abbiamo immobilizzato l''enzima
HLADH, ottenendo buone rese e una migliore enantioselettività. Abbiamo inoltre proposto un interessante
approccio enzimatico per l''ossidazione degli (S)-2-Aril Propanoli utilizzando una laccasi da Trametes
Versicolor.
L''anello β-lattamico è un eterociclo molto importante, noto per essere un interessante farmacoforo.
Abbiamo sintetizzato nuovi N-metiltio beta-lattami, che hanno mostrato un''attività antibatterica molto
interessante contro ceppi resistenti di Staphilococcus Aureus prelevati da pazienti affetti da fibrosis cistica.
Abbiamo poi coniugato gruppi polifenolici a questi nuovi β-lattami ottenendo molecule antiossidanti e
antibatteriche, cioè con attività duale. Abbiamo poi sintetizzato un nuovo ibrido retinoide-betalattame che
ha indotto differenziazione si cellule di neuroblastoma. Abbiamo poi sfruttato la reazione di aperture
dell''anello monobattamico tramite enzimi idrolitici, con lo scopo di ottenere β-amminoacidi chirali
desimmetrizzati come il monoestere dell''acido β''aminoglutamic.
Per quando riguarda gli α-amminonitrili, è stato sviluppato un protocollo di Strecker. Le reazioni sono state
molto efficienti utilizzando come fonte di cianuro l''acetone cianidrina in acqua, utilizzando differenti aldeidi
e chetoni, ammine primarie e secondarie. Per mettere a punto una versione asimmetrica del protocollo,
abbiamo usato ammine chirali con lo scopo di ottenere nuovi α-amminonitrili chirali.

5
Introduzione


La sintesi organica: storia e recenti sviluppi
La chimica sintetica per sua stessa definizione (sintesi = processo di mettere insieme) è la scienza di
costruire molecole a partire da atomi e/o molecole. Può essere suddivisa in chimica organica sintetica e
chimica inorganica sintetica, in funzione della natura delle molecole target. La sintesi infine può essere
definita a sua volta ''totale' quando ci si pone l''obiettivo di sintetizzare una molecola, spesso complessa, a
partire da semplici elementi. Nel corso degli anni la disciplina si è affermata soprattutto per l''ottenimento
di molecole bioattive e/o naturali (ma non solo), portando ad un impatto considerevole in campo medico e
farmacologico. La sintesi organica quindi è ora come ora una scienza che si pone l''obiettivo di costruire
molecole complesse per i più svariati utilizzi. All''interno della mia tesi discuterò alcune metodologie di
sintesi organica volte all''ottenimento di molecole dotate di specifiche attività biologiche: si parlerà quindi di
sintesi ''Target Oriented', cioè volta alla costruzione di molecole ''ad hoc' con un design ben preciso.

Una breve storia della sintesi organica fino ai giorni nostri
La sintesi organica ha una lunga storia rintracciabile fin dall''antichità, anche se non fu riconosciuta in
quanto tale poiché praticata senza un metodo scientifico. Come scienza la sintesi organica è quindi
relativamente giovane e si può definirne un inizio con la sintesi razionale e pensata dell''urea da parte di
Wӧhler 1 nel 1825. Da lì in poi vennero progettate altre sintesi: l''acido acetico ad opera di Kolbe2, il glucosio diFisher, 3 l''α terpinolo4, la chinina5 e tante altre. O H2N NH2 Urea O H3C OH Acido Acetico O OH HO HO HO OH Glucosio OH -terpinolo MeO HO N Chinina
L''importanza di questa disciplina fu ampiamente riconosciuta nel secolo successivo con la vincita di
numerosi Nobel da parte di chimici ''sintetici'. Tuttavia solo dopo la seconda guerra mondiale prese piede
fortemente la sintesi di molecole più complesse, in particolare molecole naturali. Si svilupparono così vere
e proprie teorie e metodologie per la sintesi organica, tra cui l''approccio retrosintetico, per cui Corey prese
il premio Nobel nel 1990.
Negli ultimi anni però la tendenza del mondo della sintesi organica e della chimica in generale si sta
fortemente indirizzando a reinventarsi tramite la green chemistry, cioè con la ricerca di uno sviluppo
sostenibile in termini ambientali. Questo significa cominciare a sostituire metodologie inquinanti ed ad alto
impatto ambientale con processi nuovi più ecosostenibili. Il professore Anastas nel 1991 ha enunciato le
basi della ''chimica verde', la chimica sostenibile, elencando i seguenti 12 principi: 6 1. ' meglio prevenire la produzione di rifiuti che trattare o ripulire i rifiuti dopo la loro formazione.
2. I metodi di sintesi devono essere progettati per massimizzare l''incorporazione di tutti i materiali utilizzati nel processo nel prodotto finale. 1 Wӧlher, F., Ann. Phys Chem., 1828, 12, 253
2 Kolbe, H., Ann. Phys Chem., 1845, 54, 145
3 Fisher, E. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1890, 23, 799 4 Perkin, W.H., J. Chem. Soc., 1904, 654
5 Woodward R. B., Doering W. E., J. Am. Chem. Soc., 1944, 66, 894. 6 Anastas, P. T.; Warner, J. C. Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University Press: New York, 1998, p.30 6
3. Per quanto possibile, le metodologie di sintesi dovrebbero essere ideate per usare o generare sostanze che abbiano poca o nessuna tossicità per la salute umana e l''ambiente. 4. I prodotti chimici devono essere progettati per preservare l''efficacia della funzione, riducendo la tossicità. 5. L''uso di sostanze ausiliarie (come solventi, agenti di separazione, ecc.) deve essere reso non necessario se possibile e innocuo, se necessario. 6. I fabbisogni di energia dovrebbero essere valutati per il loro impatto ambientale ed economico che deve essere ridotto al minimo. I metodi di sintesi devono essere condotti a temperatura e
pressione ambiente. 7. Una materia prima rinnovabile dovrebbe essere preferita ad una non rinnovabile, se ciò sia tecnicamente ed economicamente praticabile 8. Bisognerebbe ridurre i prodotti secondari dovrebbe laddove possibile
9. Bisognerebbe usare catalizzatori (più selettivi possibile)che siano recuperabili e riutilizzabili
10. I prodotti chimici devono essere progettati in modo che al termine della loro funzione non persistano nell''ambiente e diano prodotti di degradazione innocui. 11. Le metodologie analitiche devono essere ulteriormente sviluppati per consentire in tempo reale, per impedire la formazione di sostanze nocive. 12. Il processo di sintesi e l''ambiente di reazione devono essere scelti in modo da minimizzare il rischio di incidenti sia verso l''ambiente sia verso l''operatore
Tutti questi principi racchiudono in sé il senso della chimica verde (green chemistry): lo sviluppo di processi
che utilizzano la minor quantità di materiale e di energia possibile e producono quindi minor inquinamento,
il tutto nel rispetto della sicurezza degli operatori.
A livello generale, l''applicazione dei principi della green chemistry si basa sull''acquisizione di un''etica da
parte dei chimici e della stessa umanità, fondata sulla consapevolezza del rispetto dell''ambiente in quanto
risorsa limitata che necessita di tutela e protezione. In questo senso la green chemistry si traduce quindi in
una disciplina del tutto trasversale nell''ambito della chimica.
Nell''ambito della sintesi organica assume poi significati più specifici, quali:
1) limitare l''utilizzo del solvente: sviluppare reazioni in stato solido o senza solvente, oppure utilizzare
solventi a minor impatto ambientale, quali ad esempio l''acqua;
2) sviluppo di catalizzatori sempre più efficienti; sfruttare catalizzatori semplici che possono essere
recuperabili, oppure metodologie biocatalitiche.
3) limitare il numero di step sintetici; evitare se possibile l''utilizzo di gruppi protettori e fare in modo di
incorporare all''interno del prodotto finale il maggior numero di reagenti utilizzati.
4) privilegiare se possibile reazioni che avvengono a temperatura ambiente, ma se non si può sfruttare fonti
di energia alternative;

Negli ultimi anni sono quindi state messe a punto parecchie metodologie innovative che si ricollegano
proprio ad una visione nuova della sintesi organica. Nel complesso l''introduzione di queste metodologie sta
a poco a poco rivoluzionando l''approccio alla sintesi organica, dando accesso a molecole dotate di notevole
complessità per gli utilizzi più svariati, ma nel rispetto della salute e dell''ambiente. In particolare due
aspetti sono stati riconosciuti come cruciali per lo sviluppo di processi più aderenti ai principi della green
chemistry: la scelta del mezzo di reazione, cioè il solvente e la scelta di processi catalitici in opposizione a
processi stechiometrici.'

Per quanto riguarda il problema dell''utilizzo del solvente, sono noti processi che avvengono anche senza la
solubilizzazione in solvente organico e a volte addirittura due solidi sono in grado di reagire, con elevati
valori di resa e selettività. Ovviamente un processo senza solvente abbatte i costi, se è possibile trasferirlo a
livello industriale.
Un''alternativa al solvente organico che via via si sta sempre diffondendo, è la possibilità di svolgere la
reazione in acqua. L''acqua non ha mai attirato molta attenzione, per via della difficoltà di sciogliere
composti lipofili. Tuttavia la possibilità di usare miscele di acqua e solvente organico spesso riesce a 7
superare il problema dell''insolubilità. Inoltre, se i reagenti anche solo parzialmente riescono a sciogliersi, la
reazione può comunque procedere e spostare l''equilibrio verso i prodotti. In particolare però proprio la
difficile solubilità dei reagenti in acqua, li può portare a ''sciogliersi l''uno nell''altro' forzandoli in micelle
inverse, per effetto idrofobo. Questo ha il risultato di accelerare la reazione ed è quindi un notevole e
importante vantaggio cinetico.
L''utilizzo dell''acqua, e/o l''ottimizzazione di un processo che operi in queste condizioni offre numerosi
vantaggi:
- l''acqua è economica, molto più di qualsiasi altro solvente organico;
- l''acqua è sicura, non essendo infiammabile, non è né tossica, né carcinogenica;
- l''acqua consente di svolgere le reazioni senza bisogno dell''atmosfera inerte;
- l''acqua consente un miglior controllo della temperatura a causa della sua elevata capacità termica;
- l''acqua in alcuni casi facilita le reazioni organiche per effetto idrofobo.

Strettamente connesso ai principi della Green Chemistry è la ricerca di metodologie catalitiche sempre
migliori. Il massimo risultato in termini di ecosostenibilità si può raggiungere utilizzando catalizzatori in
gradi di funzionare in acqua e/o soluzioni saline: è il caso degli enzimi, biocatalizzatori fondamentali e
ubiquitari. La biocatalisi, che sta via via sostituendo catalizzatori chimici e innovando la chimica organica, è
comunque conosciuta dall''uomo da molto tempo.

La biocatalisi
La biocatalisi 7 applicata affonda infatti le sue radici nell''antica Mesopotamia, nella Cina e nel Giappone, nella produzione di cibo e delle bevande, seppur con inconsapevolezza. Un approccio alla biocatalisi più
scientifico cominciò però solo nell''800; Kirchoff, nel 1814, osservò che il glutine del grano riusciva a
convertire l''amido in zucchero. Successivamente Payen e Persoz 8 osservarono che gli estratti dei germi di orzo riuscivano a idrolizzare l''amido con l''ottenimento di destrine e altri zuccheri. Questi estratti vennero
chiamati ''diastasi' e non erano alto che miscele di amilasi; nel 1935 Berzelius riconobbe il potere catalitico
di questi estratti e da quegli anni le destrine cominciarono ad essere prodotte molto facilmente e
comunemente. 9 Ma è solo dal 1894 in poi che le prime teorie sulla catalisi di questi estratti, sulla catalisi enzimatica, cominciarono ad essere interpretate e spiegate dal Emil Fisher. Lo scienziato era convinto che
gli enzimi fossero proteine (la loro vera natura fu delucidata con sicurezza solo dopo 20 anni) e che
funzionassero con un meccanismo ''chiave-serratura'. Un passo ulteriore sulla enzimologia fu fatto da
Buchner, il quale affermò che la catalisi enzimatica non richiede necessariamente la presenza e l''azione di
cellule vive. 10 Al giorno d''oggi con la parola biocatalisi si intendono tutti i processi chimici che vengono mediati da enzimi
o cellule intere; si va quindi dall''utilizzo di tecniche biocatalitiche per la sintesi di ''fine chemicals', alle
fermentazioni per la produzione di prodotti ''bulk' quali l''etanolo e l''acido acetico. Ma all''interno della
biocatalisi c''è anche la biotecnologia e l''ingegneria genetica, cioè quelle scienze che si pongono l''obiettivo
di costruire enzimi e/o microorganismi ad hoc per svolgere funzioni specifiche.

La biocatalisi:
I vantaggi
Il primo vantaggio e aspetto positivo della biocatalisi è sicuramente strettamente connesso alla natura
stessa degli enzimi: sono catalizzatori regioselettivi, chemoselettivi e stereoselettivi particolarmente
efficienti. Questo significa che molecole polifunzionali possono essere trasformate in modo molto selettivo
e spesso evitando l''utilizzo di gruppi protettori, aspetto che non si può invece tralasciare nella normale
sintesi organica. Tutto questo si traduce in un minor numero di passaggi per una sintesi, con guadagni
economici e in termini di tempo. A questi aspetti si aggiunge anche la possibilità di poter effettuare la
sintesi in soluzioni acquosa ed evitare o diminuire l''utilizzo di solventi organici; a questo proposito molto è 7Bornscheuer U.T., Buchholz K., Eng. Life. Sci., 2005, 5, 4, 309. 8 A. Payen, J. F. Persoz, Annales de Chemie et de Physique, 2m. Série, 1833, 53, 73
9 A. Payen, Handbuch del Technischen Chemie, E. Schweizerbart''sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 1874,2,
10 E. Buchner, Ber. Dt. Chem. Ges. 1898, 31, 209; E. Buchner, Ber. Dt. Chem. Ges. 1898, 31, 209; 10 E. Buchner, Ber. Dt. Chem. Ges. 1898, 31, 209. 8
stato studiato in merito alla catalisi enzimatica in solventi organici. La chiralità sulle molecole può essere
introdotta senza l''ausilio di catalizzatori chirali, spesso costosi e molto specifici, e/o ausiliari chirali tramite
risoluzioni cinetiche, cinetico dinamiche, desimmetrizzazioni e altri processi.
L''utilizzo di sistemi biocatalici quindi consente di rispettare molte ''regole' connesse ai principi di ''green
chemistry' enunciati da Anastas

Gli svantaggi
Gli svantaggi connessi alla biocatalisi sono da ricondurre in generale alla natura dell''enzima e/o della cellula
intera. Gli enzimi possono essere molto costosi, perché devono essere prodotti, estratti e purificati dalle
cellule batteriche progenitrici. Spesso hanno bisogno di essere progettati ex-novo ma i tempi spesso sono
molto lunghi e di pari passo costosi. Possono essere riutilizzati facilmente solo se supportati, ma ad oggi
non esiste ancora una tecnica/teoria di immobilizzazione generale ed ogni enzima deve essere trattato
come un caso a parte. L''immobilizzazione in alcuni casi può risultare anche impossibile, soprattutto per gli
enzimi molto complessi come le deidrogenasi; spesso si deve quindi ricorrere alla modifica della struttura
della proteina per adattarla all''immobilizzazione. Se il costo dell''enzima non è un problema, bisogna tenere
presente che molti di loro funzionano con cofattori quali NADH, FADH; bisogna considerare il loro costo ed
eventualmente superare il problema costruendo un sistema di riciclo del cofattore. Gli enzimi inoltre
possono in alcuni casi non essere stabili, aspetto che ne impedisce una conservazione a lungo termine e ne
diminuisce la disponibilità.
Se l''utilizzo dell''enzima spesso può essere tutt''altro che facile, spesso non è così invece con le cellule intere;
i microorganismi infatti sono in genere molto resistenti, più economici e possono essere coltivi in modo da
non esaurirli mai. Un ulteriore vantaggio è correlato al fatto che essendo cellule, non hanno bisogno di
cofattori per funzionare.
La biocatalisi e l''industria
Negli anni sono stati messi a punto moltissimi processi enzimatici in tutti a campi della chimica, sia in quello
dei polimeri che dell''industria cosmetica, ma soprattutto di quelle agro-alimentare e farmaceutica 11. Un importante esempio in campo alimentare è l''idrolisi enzimatica dell''amido. Tale processo permette la
produzione di sciroppi di glucosio o oligosaccaridi di largo impiego nel settore alimentare (non più di un
terzo è invece usato nell''industria tessile e della carta). Per molto tempo l''idrolisi è stata effettuata
chimicamente, con acidi inorganici e alte temperature. Con tale metodo le rese non sono elevate e si
ottengono diversi sali e sottoprodotti indesiderati (soprattutto lo psicosio, zucchero non metabolizzabile)..
Altri enzimi come le pectinasi chiarificano i succhi di frutta. Molto importante è l''utilizzo invece delle lattasi:
questi enzimi idrolizzano il lattosio, disaccaride che provoca spesso intolleranza, a galattosio e glucosio,
aumentando quindi la digeribilità del latte.
Nell''ambito dei detersivi sono utilizzate diverse lipasi, amilasi e proteasi per rimuovere le macchie di varia
natura.
L''industria farmaceutica è un altro importante settore dove viene sempre più applicata la biocatalisi. Oltre
alla produzione per via fermentativa di prodotti farmacologicamente attivi (ad es: antibiotici come
penicilline e cefalosporine, antitumorali e macrolidi), altre tipologie di processi biocatalitici possono trovare
applicazione nell'' industria chimico-farmaceutica,
soprattutto per la sintesi di farmaci molto complessi
Come esempio si può esaminare la sintesi del''Indinavir, importante inibitore della proteasi di HIV. . 11 Straathof,A. J.J.; Sven Panke, S. and Schmid, A., Current Opinion in Biotechnology 2002, 13, 548''556 9
Tramite la biocatalisi si può sintetizzare la parte dell''amminolo biciclico chirale, utilizzando diversi enzimi e
approcci. 12 L''amminolo viene infatti sintetizzato a partire dall''indene con l''utilizzo di due passaggi di sintesi su tre
catalizzati da enzimi.

Grazie all''ingegneria genetica si può ''programmare' un microorganismo in modo che produca enzimi
specifici con lo scopo di indurre una determinata trasformazione chimica. E'' il caso della ''DuPont Tate &
Lyle BioProducts' che ha ingegnerizzato un ceppo di E. Coli per produrre 1,3 propandiolo a partire da
glicerolo.
Viene effettuata una disidratazione per opera di una glicerolo deidratasi e dopo equilibrazione chetoenolica
si procede ad una riduzione con l''enzima ADH. L''importanza dell'' 1,3 propandiolo sta nel suo utlizzo come
liquido antigelo, solvente, precursore di polimeri e componente essenziale di numerosi prodotti industriali.
Questo processo biocatalizzato offre una alternativa alla via chimica molto più ''costosa' soprattutto in
termini di ecosostenibilità.
Se l''ingegneria genetica offre queste possibilità, l''utilizzo anche di strumenti computazionali può
permettere l''accesso alla sintesi di enzimi artificiali. Recentemente è la creazione di una ''Diels Alderasi',
proteina in grado di promuovere la reazione di Diels Alder, del tutto sconosciuta in natura. Baker e il suo
gruppo nel 2010 hanno prodotto un enzima in grado di catalizzare questa reazione, modellandolo a priori
tramite un algoritmo computazionale e poi sintetizzandolo con un microorganismo.

La reazione promossa da questo enzima artificiale è risultata enantio e diastereoelettiva,.

La sintesi organica per la costruzione di molecole biologicamente attive
La progettazione di molecole biologicamente attive è un aspetto che affronta tematiche trasversali che
vanno dalla biologia molecolare, alla microbiologia, alla chimica organica e alla sintesi delle molecole. 12 M. Chartrain, B. Jackey, C. Taylor, V. Sandfor, K. Gbewonyo, L. Lister, L. Dimichele, C. Hirsch, B. Heimbuch, C. Maxwell, D. Pascoe, B. Buckland, R.
Greasham, J. Ferment. Bioeng. 86 (1998) 550''558. 19. B. Buckland, D. Robinson, M. Chartrain, Metab. Eng (2000) 42''48. 20. M. Chartrain, P.
Salmon, D. Robinson, B. Buckland, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000) 209''214. 21. N. Zhang, B. Stewart, J. Moore, R. Greasham, D. Robinson, B.
Buckland, C. Lee, Metab. Eng. 2 (2000) 339''348. 22. A. Amanullah, C. Hewitt, A. Nienow, C. Lee, M. Chartrain, B. Buckland, S. Drew, J. Woodley,
Biotechnol. Bioeng. 80 (2002) 239''249. 10
L''identificazione del target biologico su cui progettare la sintesi della molecola (lead) non è che l''inizio del
cammino che porta all''ottenimento del ''farmaco'. Occorre infatti seguire razionalmente alcuni step
fondamentali:
1) Identificazione e scelta del target farmacologico;
2) Studio del sito attivo/recettoriale tramite metodologie dirette o indirette e dell''interazione e dello
scaffold molecolare che meglio di adatta;
3) Sintesi della molecola.

Identificazione e scelta del target biologico
In primo luogo è necessario identificare il target biologico, generalmente un enzima o una proteina, e
costruire una molecola che sappia interagire con essi in modo da bloccarne, inibirne o più generalmente
modificarne l''attività. L''esercizio di questa attività nei confronti della proteina, classifica la molecola come
farmaco. L''interazione tra una molecola ed un enzima fu ipotizzata per la prima volta da Hermann Emil
Fischer nel 1894, secondo il quale l'enzima e il substrato possiedono una forma esattamente
complementare che permette ''un''incastro' perfetto. 13 Tale interazione venne definita ''modello chiave- serratura' e suggeriva che una molecola e/o classi di molecole affini avessero la capacità unica di ''aprire'
l''enzima, cioè di interagire in maniera molto specifica con la proteina esercitando una determinata
funzione. L''interpretazione dell''interazione tra l''enzima e substrato si è però evoluta nel tempo; si è
cominciato ad osservare che l''enzima non si comportava in maniera così rigida nei confronti dei suoi
substrati e il suo stesso sito attivo veniva modificato dal legame con le molecole. Si arrivò a definir quindi
un nuovo modello, detto ''mano-guanto '' o anche ''modello dell'adattamento indotto'. 14 L''enzima giustamente non venne più considerato come una struttura rigida ma bensì dotato di un certo grado di
flessibilità, caratteristica che gli consentiva di modellarsi in base alla presenza del substrato o meno. Il
substrato quindi si lega al sito attivo e induce sull''enzima un cambiamento dovuto all''adattamento dello
stesso enzima.

Lo studio del sito attivo
Il sito attivo di una proteina è la parte che lega il substrato e che induce l''enzima ad esercitare la sua
attività. Da un punto di vista teorico viene suddiviso in sito di legame (dove avviene il legame con il
substrato) e sito catalitico (dove avviene in effetti esercitata la funzione catalitica). Alcuni enzimi
possiedono anche siti detti allosterici, che interagiscono con molecole dette effettori allosterici: queste
molecole possono essere oppure no anche i substrati dello stesso enzima ma in generale modificano
l''attività dell''enzima inducendo cambiamenti della struttura. I siti attivi e/o i siti allosterici devono essere
identificati per poter capire la struttura delle molecola in grado di poter interagire; una metodologia diretta
è sicuramente l''utilizzo dei raggi X della proteina target legata ad un suo substrato.
Se però non è possibile risalire alla struttura del recettore, si ricorre a delle tecniche computazionali, tra cui
spicca la tecnica QSAR (relazione quantitativa struttura-attività). Questa metodologia stabilisce una
relazione tra la struttura molecolare e l''attività biologica di una serie di composti notoriamente attivi nei
confronti della proteina target. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall''analisi delle loro
similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del sito attivo/recettoriale.
Identificati i requisiti strutturali della molecola o della classe di molecola che esercita l''attività biologica, si
può passare all''approccio sintetico.
La sintesi di molecole biologicamente attive, identificato un modello farmacoforico, si può orientare verso
differenti approcci: 1) Target Oriented synthesis (TOS); 2) costruzione di library combinatoriali; 3) Diversity
Oriented Synthesis (DOS).
La sintesi ''target oriented' è una metodologia che porta alla produzione di un''unica molecola, con un set di
sostituenti e spesso con un cammino di sintesi molto specifico. Questa metodologia è stata una delle prime
ad essere utilizzata 15 ma in generale viene scelta quando il target molecolare ha una attività biologica forte e comprovata oppure ha una notevole complessità.. Questo tipo di approccio però limita molto le 13 Fischer E., 1894, Ber. Dt. Chem. Ges. 27: 2985-2993.
14 Koshland D. E., Proc. Natl. Acad. Sci,. 1958, 44 (2): 98-104 15 E. J. Corey and X.-M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (Wiley, New York, 1989) 11
possibilità di variare lo ''scaffold' molecolare, per via della natura spesso molto specifica della via di sintesi
scelta (che spesso si avvale di una strategia retrosintetica).
La sintesi combinatoriale, divenuta molto famosa soprattutto grazie alla sintesi peptidica su fase solida di
Merrifield degli anni 70, 16 permette di ottenere una serie di n scaffold molecolari in un solo processo di sintesi, ottenendo quindi una grande diversità di substrati ottenuti. Dal punto di vista sintetico e operativo
l''approccio combinatoriale permette di ampliare e arricchire il numero di molecole simili i, variando i
sostituenti in modo casuale e ottenendo cosi'' diverse combinazioni. Tramite questo schema si vede come, a
partire da una unica molecola riconosciuta come composto capostipite (lead compound), si può ottenere,
un numero elevato di nuove molecole generate da combinazioni di sostituenti diversi.
La chimica combinatoriale si è particolarmente diffusa e ha dato luogo a tecniche quali lo ''split and mix' e
molte altre.
.
Il vasto numero di molecole ottenibili grazie alla chimica combinatoriale permette di estendere quello che
si definisce lo ''spazio chimico'. Lo spazio chimico è una zona virtuale a n dimensioni, dove le dimensioni
sono ''descrittori' di caratteristiche strutturali o chimico-fisiche (ad es. formula bruta, tavola di connessione
molecolare, polarità (logP), volume molare, numeri di legami liberi di ruotare etc.). Lo spazio chimico dà
un''idea della diversità delle molecole. Si stima che il numero di molecole possibili è 10 200; quelle che possono essere attive dal punto di vista biologico, sono 10 60. Dalla letteratura però, nel corso degli anni, sono state sintetizzate solo 10 7 molecole differenti. Se paragoniamo lo spazio chimico di una sintesi ''target oriented' e di una combinatoriale, si nota subito come la seconda metodologia porta ad una maggiore
variabilità e quindi ad una maggior percentuale di successo nell''identificare nuove molecole attive.
.
Il vantaggio della sintesi combinatoriale è notevole se si considera che spesso una molecola target può sì
essere in grado di esercitare la sua attività biologica, ma allo stesso tempo potrebbe essere tossica, o
portare a problemi di altra natura (problemi di assorbimento, escrezione, interazione contemporanea con
altre proteine..). La possibilità di avere altre n-1 strutture analoghe ma leggermente diverse, come può
garantire la costruzione di library combinatoriali, porta alla scoperta di molecole aventi con molta
probabilità la stessa attività biologica (anche se eventualmente leggermente diminuita) ma non risultare
tossiche.
Nel 2004 il professor Schreiber 17 ha proposto un approccio di sintesi che porta ad un ulteriore ampliamento dello spazio chimico; la ''diversity oriented synthesis'. Questa metodologia va oltre l''approccio
combinatoriale e si propone di elaborare strategie per sintetizzare molecole molto diverse a partire da
molecole simili. Questo esempio mostra come da una molecola molto funzionalizzata, tramite 8 reazioni
differenti, si ottengono 7 prodotti molto diversi tra di loro a partire dalla stessa molecola di partenza. 18 16 R. B. Merrifield (1963), Journal of the American Chemical Society 85 (14): 2149 17 Martin D. Burke and Stuart L. Schreiber, Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 46''58
18 N.Kumagai, G. Muncipinto, S. L. Schreiber , Angewandte Chemie International Edition, 2006 45, 22 , 3635. 12

Nello spazio chimico, questa strategia si traduce nell''ottenimento di un numero maggiore di potenziali lead
compounds, con un numero di variabili n molto superiore a quello che può offrire la chimica combinatoriale.
Se poi consideriamo che l''aumento dello spazio chimico è correlato, come trattato in precedenza,
all''aumento del successo di un determinato lead, possiamo affermare che la diversity oriented sytnthesis,
detta anche sintesi divergente, probabilmente potrà offrire grandi vantaggi. La sintesi divergente apre le porte al concetto di analisi Forward, il contrario della analisi retrosintetica. Se
in una analisi retrosintetica ci si chiede come una molecola complessa può essere sintetizzata a partire da
elementi semplici, in una analisi Forward ci si chiede come una collezione di molecole semplici e simili
possono essere trasformati in una library di prodotti complessi.


Le classi di molecole sintetizzate durante il mio dottorato
Durante il mio periodo di dottorato ho utilizzato metodologie di sintesi organica e tecniche biocatalitiche
con lo scopo di ottenere molecole biologicamente attive.

I β-lattami
La prima classe di molecole di cui mi sono occupato è quella dei β-lattami, molecole note soprattutto per la
loro attività biologica come antibiotici. L''anello β-lattamico in natura è presente in strutture bicicliche quali
le penicilline e le cefalosporine, ma anche da solo come testimoniano le nocardicine.
Abbiamo sintetizzato una library di nuovi antibiotici monobattamici N-tiolati, per conferire allo scaffold β-
lattamico un''attività biologica di natura antibatterica.
13
N R O SMe R1 OTBS OH R1 = H R = OAc, SAc, SO2Ph N O SMe R1 COOR R = Et, Bn OTBS OH R1 = H Questi nuovi antibiotici sono risultati attivi su ceppi batterici resistenti di S. Aureus e anche su ceppi
prelevati da pazienti affetti da fibrosi cistica.
Per aumentare l''efficacia di questi antibiotici, abbiamo successivamente progettato e costruito β lattami
coniugati a polifenoli, per conferire anche potere antiossidante. Questa modifica ha permesso di ottenere β
lattami che hanno mostrato una certa attività antibiotica e una discreta attività antiossidante.
Abbiamo poi sintetizzato β lattami attivi nell''ambito del differenziamento cellulare, processo per cui una
cellula matura e raggiunge una certa speciazione. Questo è stato possibile coniugando un monobattame 4-
alchilidene ad un derivato retinoico, cioè appartenente ad una classe di molecole note per interagire nei
processi di differenziamento. NH O H N O
I profeni
I profeni sono molecole largamente utilizzate in ambito farmacologico in quanto antiinfiammatori non
steroidei molto efficaci. Sono molecole chirali e gli studi di letteratura hanno dimostrato che l''attività
biologica viene svolta in prevalenza dall''enantiomero S. La diffusione di questa classe di molecole e la sua
commercializzazione e produzione su larga scala, ha portato alla ricerca e alla validazione di numerosi
processi di sintesi. Durante il mio periodo di tesi abbiamo sviluppato una metodologia chemo-enzimatica
per la sintesi di Profeni enantiomericamente puri partendo da aldeidi arilpropioniche.
HLADH (R,S) (S) OH O H (S) OH O PBS, MeCN NADH(cat), EtOH PBS, Organic Solvents NaClO2,TEMPO(cat) R R R NaClO(cat)
La metodologia prevede una bioriduzione catalizzata dall''enzima Horse Liver Alcohol dehydrogenase
(HLADH) con l''ottenimento di (S)-Profenoli in elevata resa ed eccesso enantiomerico, grazie all''attivazione
di un meccanismo di risoluzione cinetico-dinamica. Ho poi studiato la ossidazione (S)-Profenoli ad (S)-
Profeni utilizzando NaClO2 come ossidante stechiometrico, e NaClO e TEMPO come ossidanti catalitici. Un
ulteriore miglioramento della procedura è stato ottenuto con la biocatalisi. In particolare grazie ad uno
stage che ho fatto presso l''universita'' di Dublino (progetto Marco Polo , università di Bologna) è stato
supportato l''enzima HLADH su resina epossidica, consentendo il recupero del biocatalizzatore e osservando 14
in generale una miglior stabilità in differenti solventi organici associati ad una migliore enantioselettiva. In
seguito abbiamo poi studiato e realizzato una procedura di ossidazione dei profenoli a (S)-Profeni
utilizzando l''enzima laccasi estratto dal fungo Trametes Versicolor.

Gli α-amminonitrili
L''ultima classe di molecole di cui mi sono occupato è quella degli α-amminonitrili. L''estrema importanza
degli α-amminonitrili risiede nella capacità di poterli convertire in amminoacidi tramite semplice idrolisi
della funzione nitrile ad acido carbossilico. Una delle più famose procedure per la sintesi di α-ammino
nitrili è il protocollo di Strecker, che consiste nel trattamento con HCN o cianuri alcalini di immine
preformate partendo da composti carbonilici e cloruro di ammonio. Nel corso della mia tesi ho studiato un
nuovo protocollo di sintesi di Strecker, che sfrutta la reazione tra aldeidi, ammine e acetone cianidrina in
acqua.
+ R O R1 N H R2 R3 CH3 H3C CN HO r.t. R R1 N R2 R3 CN + H2O
Il protocollo si è dimostrato molto efficace, portando ad alte rese sia utilizzando aldeidi e chetoni come
composti carbonilicie ammine primarie e secondarie come ammine.
In seguito abbiamo esteso lo studio alla sintesi di α-ammino nitrili chirali, utilizzando ammine chirali
appartenenti al ''chiral pool' studiando la diastereoselezione del nostro protollo. Ci siamo poi focalizzati in
particolare sulla L-Prolina,ottenendo nuovi α-amminonitrili chirali molto funzionalizzati. R H CN HO O + H2O N H R2 R1 N R2 R1 CN R N R2 R1 CN R R = Ph, Pr, iPr, tBu R1 = H, OH R2 = CH2OH, COOMe, C(Ph)2OH










15
1
β-LATTAMI


1.1 Struttura chimica dei β-lattami
I β-lattami, chiamati anche 2 azetidinoni, sono ammidi cicliche a 4 termini. Il legame chimico dell''azoto al
carbonio in β rispetto al gruppo carbossilato porta le molecole a definirsi β lattami. NH O La struttura ciclica a 4 termini porta i carboni α e β, ibridizzati sp 3, ad avere angoli di legame inferiori a 109,5 ° conferendo alla molecola un certo grado di tensione angolare. Questo porta i β lattami ad essere
molto suscettibili alla reazione di apertura dell''anello da parte di nucleofili.
Un altro aspetto che favorisce l''apertura dell''anello β lattamico è l''assenza di delocalizzazione del doppietto
dell''azoto ammidico in quanto la struttura che ne deriverebbe, con un atomo di azoto ibridizzato sp 2, porterebbe ad una tensione troppo elevata






Tutto ciò porta i βlattami ad avere delle caratteristiche chimiche peculiari non riconducibili alla classica
reattività delle ammidi. Si può quindi schematizzare la chimica dei β lattami in questo modo:
- reattività del gruppo carbossilico paragonabile a quella di un chetone, mancando la delocalizzaione tipica
dei derivati degli acidi carbossilici;
- basicità dell''azoto più simile a quella di una ammina (con una ibridizzazione sp 3 dell''azoto) che di una ammide;
- tensione angolare della struttura ciclica che porta il β lattame ad essere molto suscettibile nei confronti
dell''apertura da parte di nucleofili.














16

1.2 L''anello β-lattamico nelle molecole biologicamente attive: Antibiotici
L''anello β-lattamico appare ubiquitario all''interno di numerose molecole dotate di attività biologica. Il loro
ruolo principale è sicuramente quello di far parte di una importante classe di antibiotici, gli antibatterici β-
lattamici.

2.2.1 β-lattami come antibiotici
Gli antibiotici sono molecole in grado di mostrare attività farmacologica verso microorganismi quali batteri,
funghi o protozoi. Il termine antibiotico fu coniato nel 1942 dallo scienziato Selman Waksman 19 e includeva tutte quelle molecole prodotte da microorganismi in grado di contrastare la vita e la sopravvivenza di altre
specie microbiche, considerando quindi solamente molecole di origine naturale. Queste molecole vengono
definite metaboliti secondari, in quanto non fondamentali per la crescita e lo sviluppo del microorganismo.
La definizione di antibiotico nel corso degli anni è stata ampliata e generalizzata per includere anche
molecole di sintesi che derivavano dalla modificazione di sostanze di origine naturale e dalla progettazione
ex novo di nuovi composti.
Gli antibiotici non definiscono un''unica classe di molecole, ma ne fanno parte diverse in funzione della
struttura chimica caratterizzante. Ogni classe di antibiotici esercita la sua attività con modalità unica; tra le
diverse classi di antibiotici, si hanno i β-lattami, i sulfamidici, chinoloni, macrolidi, tetracicline, polimixine. La modalità d'' azione è molto diversa e sono legate all''interferenza con i meccanismi biochimici che regolano il
ciclo vitale delle cellule batteriche. I sulfamidici interferiscono con il metabolismo energetico dei batteri, i
chinoloni interferiscono con la sintesi degli acidi nucleici, i macrolidi e le tetracicline con la sintesi proteica e
le polimixine con la membrana plasmatica.
Gli antibiotici β-lattamici sono una classe di molecole naturali e di sintesi caratterizzate dalla presenza di
una struttura ciclica di natura azetidinonica. Essi sono suddivisi in alcune principali categorie strutturali: le
penicilline, le cefalosporine, i carbapenemi e i monobattami. N S O H N O R X N O H N O R S N O COOH OH X NSO3 O H N R R' COOH COOH Penicillina Cefalosporina Carbapeneme Monobattame

Le penicilline e le cefalosporine da sole rappresentano a tutt''oggi più della metà degli antibiotici prodotti ed
usati nel mondo. La loro scoperta risale al 1928 grazie all''inglese Fleming 20, che identificò la penicillina G, prodotta dalla muffa Penicillium notatum.
La molecola mostrò subito un''ottima attività contro ceppi batterici Gram-positivi,
ed essa divenne l''antibiotico β-lattamico capostipite di una grande famiglia di
farmaci sintetizzati e utilizzati fino ai nostri giorni. L''efficacia di questa molecola
fu di mostrare attività antibatterica specifica accompagnata da una scarsa
tossicità verso le cellule umane eucariote.
L''attività antibatterica degli antibiotici β-lattamici è associata alla loro interazione con le proteine
responsabili della reticolazione della parete cellulare batterica Essa è composta da una componente
fibrillare polisaccaridica di strati sovrapposti di peptidoglicano, un polimero costituito da unità alternate di
NAG (N-acetilglucosammina) e NAM (N- acetilmuramico) collegate tra loro da una piccola catena peptidica
La reticolazione tra le diverse catene polimeriche avviene tramite dei ponti di pentapeptide costituito da
sola glicina; a livello biosintetico questa reticolazione avviene per opera di un enzima serino dipendente, il
quale promuove la formazione del legame peptidico tra l''ultima glicina del cross-link pentaglicinico di una
catena e la D-alanina dell'' altra catena. Questo enzima è chiamato transpeptidasi ed è target bersaglio delle
Penicilline. 19 Davey PG, 2000,. Concise Oxford Textbook of Medicine. Oxford: Oxford University, Press. pp. 1475
20 Abraham, E. P., Le Scienze 1981, 24 17

La presenza dell''anello azetidinonico nelle penicilline (e in tutte le molecole di natura β-lattamica) è
responsabile, come detto in precedenza, della peculiare reattività di queste molecole. Nei confronti di un
nucleofilo l''anello si apre secondo lo schema qui rappresentato NR O Nu NR O Nu NR O Nu L''attacco nucleofilo al β-lattame porta alla formazione di un legame covalente di natura irreversibile,
essendo la forma aperta dell''ammide altamente più stabile. 1. L''effetto farmacologico esplicato dall''anello azetidinonico è quello di formare un legame con il residuo idrossilico della serina dell''enzima che attacca il carbonio carbonilico del β-lattame. L''acil-
enzima che si forma perde irreversibilmente la sua capacità di catalizzare la sintesi del legame
peptidico con l''effetto immediato di non riuscire più a sintetizzare il peptidoglicano con sufficiente
grado di reticolazione e portando alla morte il batterio per lisi della parete cellulare. 21 Lo studio delle relazioni struttura-attività delle penicilline ha portato al riconoscimento di specifiche
caratteristiche strutturali che le penicilline dovrebbero Gruppo carbossilato, per l'interazione con
una funzione cationica della transpeptidasi 2. Gruppi metilici della penicillina simili al metile terminale della D-Ala (del peptidoglicano)
3. Catena acil-amminica in 6 analoga della D-Ala interna (del peptidoglicano)
Si osservò poi i diversi gruppi acilici (R), condensati al gruppo amminico in posizione 6, influenzavano lo
spettro anti-microbico e le proprietà farmacocinetiche delle molecola.
Lo schema mostra alcuni sostituenti della funzione amminica laterale delle principali penicilline naturali.
R Nome Penicillina K Penicillina F Penicillina X Penicillina G Penicillina V
La scoperta degli antibiotici β-lattamici ha rappresentato un enorme passo in avanti verso la cura di
moltissime infezioni che in molti casi erano letali, ma tuttavia l''abuso di questi farmaci ha causato lo
sviluppo del fenomeno della resistenza batterica, che ha spinto e spinge tuttora la ricerca farmacologica
verso lo studio e la sintesi di nuovi farmaci in grado di contrastare ceppi batterici sempre più aggressivi.

La resistenza batterica
22 La resistenza batterica viene comunemente definita come la capacità posseduta da alcune specie di
sopravvivere e di moltiplicarsi in presenza di quantità di antibiotico in grado di inibire o uccidere
microorganismi appartenenti alla stessa specie. 21 Mascaretti, A. O.; Boschetti, C. E.; Danelon, G. O.; Mata, E. G.; Roveri, O. A., Current Medicinal Chemistry 1995, 1441
22 (a) Archer G. et al, Science 291,1915, 2001; (b) Zhang H. Z. et al, Science 291,1962, 2001; (c) Lessard I. et al, PNAS 96,11028-11032, 1999; (d) M. C.
Henry, Science / Technology March 6, 2000; (e)J. R. Knowles, Acc. Chem. Res., 1995, 18, 97 18
Il fenomeno della resistenza di alcuni ceppi batterici è comunque noto fin dai primi tempi in cui si mosse la
ricerca in tale ambito; tuttavia si parlava ancora di resistenza naturale ed era per esempio posseduta dai
batteri Gram-negativi (che erano in grado di inattivare la penicillina). Ma a fianco di questa resistenza si
cominciò a sviluppare il fenomeno della resistenza acquisita. Non si riusciva cioè ad arrestare la crescita di
batteri con antibiotici che precedentemente erano in grado di farlo. Grande interesse è da sempre stato
rivolto ai ceppi di Staphylococcus Aureus, batterio Gram-positivo responsabile di serie patologie della cute,
dell''apparato scheletrico, urinario, respiratorio e del sistema nervoso centrale.
I primi ceppi di Staphylococcus Aureus resistenti alla penicillina risalgono al 1942. Per contrastarli si sostituì
la penicillina con la meticillina, fino alla comparsa di fenomeni di resistenza anche nei confronti di questo
farmaco; i MRSA sono i ceppi batterici di Staphylococcus Aureus resistenti alla meticillina legati soprattutto
alle infezioni contraibili in ambito ospedaliero.
Dagli anni ''80 si cominciò allora ad utilizzare la vancomicina e la teicoplanina. Tuttavia la verifica di episodi
di resistenza anche nei confronti della vancomicina e in generale nei confronti di altri farmaci mostra che la
ricerca scientifica si deve muovere verso la sintesi e la scoperta di nuovi farmaci in grado di contrastare
ceppi batterici sempre più forti e pericolosi.
La causa della resistenza batterica si ritrova nella capacità dei ceppi batterici di sapersi via via adattare agli
antibiotici utilizzati in larga scala; i meccanismi con cui riescono a portare avanti questa caratteristica sono
fondamentalmente due:
1) mutazione spontanee o rafforzative con selezione naturale del batterio;
2) scambio e acquisizione di geni tra ceppi e specie.
Nel primo caso si tratta quindi di selezione naturale, ovvero solo le specie batteriche che riescono a
resistere alla ''pressione ambientale' sopravvivono e perpetuano la specie. La capacità di resistere è dovuta
all''acquisizione di caratteristiche generate dalla mutazione di un gene appartenente al batterio; il
fenomeno della mutazione spontanea è un evento che si genera circa ogni 10 7 divisioni cellulari, e si trasmette alle cellule figlie. Si parla di trasmissione della resistenza in modo ''verticale'. L''uso massivo e non
controllato di antibiotici, oltre che causare la morte dei batteri, spinge quelli resistenti a moltiplicarsi e a
dividersi, aumentando così la probabilità di mutazioni che possono portare alla resistenza acquisita. La
probabilità di ottenere una mutazione spontanea utile, cioè che rende il batterio resistente ad agenti che lo
contrastano, è comunque remota e cioè 1/10 28. Tuttavia succede anche che specie non resistenti possano scambiare e ricevere materiale genetico da batteri che sopravvivono e quindi mutare direttamente,
acquisendo resistenza. Si parla questa volta di trasmissione della resistenza in senso ''orizzontale' ed è ciò
che corrisponde al secondo punto.
I meccanismi con cui viene manifestata la resistenza batterica sono molteplici:
1) Modificazione della struttura delle transpeptidasi utilizzate per costruire la parete cellulare;
2) modificazione della membrana esterna (soprattutto per i Gram''negativi), che provoca la perdita o la
trasformazione della struttura delle porine, con l''effetto di diminuire la permeabilità del batterio alla specie
antibiotica;
3) aumento della capacità dei batteri di espellere le molecole di antibiotico, con una sovraregolazione dei
meccanismi che regolano appunto l''efflusso;
4) acquisizione della capacità di produrre delle β-lattamasi, proteine in grado di idrolizzare velocemente i
substrati β-lattamici.
La produzione delle β-lattamasi rappresenta il meccanismo più efficace attraverso cui i batteri riescono a
manifestare il fenomeno della resistenza: queste proteine sono prodotte sia da batteri Gram-negativi che
Gram-positivi; per i primi esse sono costitutive, mentre per i secondi la biosintesi avviene quando il
microorganismo viene a contatto con il farmaco. Esistono molte categorie di β-lattamasi 23, ma la maggior parte di queste può essere ricondotta alle classi A,C,D (β-lattamasi seriniche) e B (metallo enzimi). Per la
prima classe sono comunque disponibili inibitori specifici, tra i quali sono noti l''acido clavulanico, il
tazobactam e il sulbactam. 23G. P. Ellis, D. K. Luscombe, Progress In Medicinal Chemistry, 1994, 31, 297 19
acido clavulanico tazobactam sulbactam

Queste molecole vengono somministrate in genere assieme ad un altro substrato β-lattamico che funge da
antibiotico, in modo da contrastare le β-lattamasi e avere una maggiore efficacia antibatterica del farmaco.
Tra i farmaci in commercio si ricorda Augmentin ® (amoxicillina e acido clavulanico), Timentin® (ticarcillina e acido clavulanico), Unasyn ® (ampicillina e sulbactam) e Zosyn® (piperacillina e tazobactam). Le cause che portano all''aumento del fenomeno della resistenza batterica possono sostanzialmente essere
ricondotte all''abuso di antibiotici da parte dell''uomo, che negli ultimi anni si è fatto sempre più persistente,
soprattutto nei paesi più industrializzati. Gli antibiotici non vengono utilizzati solo in ambito clinico, ma
anche per l''agricoltura, per l''acquacoltura e per l''allevamento; il problema della resistenza batterica e tutto
ciò che ne deriva si osserva quindi nell''uomo come negli animali e nelle piante. Il fenomeno pare quindi
associato ad un utilizzo globale e in larga scala di questi farmaci, che ha portato i ceppi batterici ad evolvere
nel tempo molto velocemente e a sviluppare meccanismi di resistenza.
D''altra parte purtroppo l''insorgenza di patologie molto serie e croniche portano gli individui ad un
fenonemeno di dipendenza obbligatoria dagli antibiotici, da cui non si può quindi prescindere.
Per contrastare quindi il fenomeno della resistenza batterica sono possibili quindi due vie:
1) utilizzo di antibiotici strettamente sotto controllo medico, in modo che essi vengano prescritti solo se
davvero necessario e con eziologia batterica;
2) sviluppo di nuovi farmaci in grado di contrastare ceppi batterici multiresistenti, che mostrino
eventualmente un''attività con un nuovo meccanismo di azione.

Resistenza batterica e fibrosi cistica
Il fenomeno della resistenza batterica assume toni molto seri su pazienti affetti da patologie croniche che in
virtù della loro condizione sono costretti ad assumere antibiotici spesso in maniera continuativa e
prolungata. E'' il caso di pazienti affetti da cancro, di persone che hanno subito dei trapianti e di malati di
Fibrosi Cistica (FC). La fibrosi cistica è una malattia genetica autosomica recessiva causata dalla mutazione
del gene CFTCR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) che codifica una proteina situata
sulla membrana cellulare delle cellule epiteliali, la cui funzione è quella di trasportare il cloro attraverso
le membrane cellulari a livello della membrana apicale delle cellule epiteliali delle vie aeree, del pancreas,
dell'intestino, delle ghiandole sudoripare, delle ghiandole salivari e dei vasi deferenti. L''anomalo trasporto
del cloro porta le ghiandole interessate alla secrezione di un muco denso e viscoso le cui conseguenze sono
l''insorgenza di infezioni polmonari, insufficienza pancreatica e numerose altre sintomatologie, associate ad
uno stato infiammatorio e anche all''incremento della concentrazione di neutrofili e altri leucocici. A livello
del sistema respiratorio in particolare, la natura del tessuto polmonare di questi pazienti è il terreno adatto
per la crescita di specie batteriche difficilmente debellabili. Studi clinici recenti mostrano lo sviluppo di
ceppi resistenti di MRSA proprio in questi pazienti che hanno la capacità di sviluppare biofilm, di sintetizzre
la tossina PVL (Panton''Valentine leukocidin) e causare complessivamente un danneggiamento della
funzionalità polmonare e quindi minare seriamente la sopravvivenza del paziente.

I monobattami
La ricerca e lo studio di questa particolare classe di strutture β-lattamiche è rivolta a individuare nei
monobattami nuovi potenziali antibiotici, con l''obiettivo di contrastare quei ceppi batterici che cominciano
a mostrare resistenza multi farmaco. Anche i monobattami, come le strutture bicicliche (penicilline e
cefalosporine), possono infatti avere la stessa reattività nei confronti delle peptidasi batteriche. Ma la
struttura monociclica può aprire la strada ad un nuovo meccanismo di azione. L''unico antibiotico a
struttura monobattamica utilizzato in ambito farmacologico è l''Aztreonam. N O O O OH N O S CH3 CH3 O OH OH O O N O S CH3 O OH O O N N N 20
Questo perché l''interesse verso antibiotici β-lattamici di natura monociclica si è sviluppato solo verso la fine
degli anni ''70 e l''inizio degli anni ''80, periodo in cui queste molecole furono estratte per la prima volta da
fonti naturali.
Si scoprirono le nocardicine, 24 ottenute da culture di gluconobacter e acetobacter , e altri derivati monobattamici 7 naturali a struttura N-sulfonica. I primi derivati sintetici ottenuti da strutture monobattamiche possedevano vari tipi di sostituenti anionici
sull''atomo di azoto 8. N R O R'OCHN OSO3 - N R O R'OCHN PO3 2- N R O R'OCHN OPO3 2- N-Solfato N-Fosfato N-Fosfonato
Queste molecole mostrarono un''attività a largo spettro contro batteri anaerobici Gram-negativi ma una
inconsistente o nulla attività contro i Gram-positivi come lo Staphylococcus aureus. I motivi ipotizzati
furono:
Impropria posizione della carica anionica netta che derivava dalla deprotonazione dell''acido idrossamico,
rispetto alle altre molecole attive.
Dislocazione della carica all''interno dell''anello per effetto mesomerico, che portava la struttura
azetidinonica ad essere più elettronricca e perdere la caratteristica reattività verso nucleofili.
Nel 1985 furono sintetizzati altri derivati monobattamici, 25 le ossamazine e le tiamazine. N R O R'OCHN OCH2COOH N R O R'OCHN SCH2COOH Ossamazine Tiamazine Le prime mostravano una forte attività antimicrobica, a discapito dei derivati solforati. Di queste due
molecole sono stati fatti studi ab initio 10 per determinare i parametri strutturali e riuscire a giustificare la differente attività biologica.
Determinante era la maggior lunghezza del legame N-S rispetto al legame N-O; questa caratteristica
consentiva alla tiamazina di formare più facilmente un legame a idrogeno intramolecolare molto forte tra il
protone carbossilico e l''ossigeno carbonilico, interazione geometricamente più impedita per l''ossamazina.
L''impegno del gruppo ammidico del β-lattame in un legame a idrogeno provoca però una minore attività
biologica e può quindi spiegare la mancanza di attività di questa classe di biomolecole.

N-tiometil β-lattami 24 a) Imada A., Kitano K., Kintaka K., Muri M., Asai M., Nature 1981, 289, 590; b) Sykes R. B., Cimarusti C. M., Bonner D. P., Bush K., Floyd D. M.,
Georgopapadakou N. H., Koster W. H., Trejo W. H., Wells J. S., Nature 1981, 291, 489; c) Kamiya T., Hashimoto M., Nakaguchi O., Oku T.,
Tetrahedron Lett., 1979, 35, 323
25 Woulfe S. R., Miller M. J., Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3293 21
Gli N-tiometil β-lattami sono oggetto di studio già alcuni anni per la loro attività biologica su ceppi batterici
resistenti quali MRSA e specie Bacillus 14. N R O SMe R1 La sintesi di β-lattami con un legame N-S ma privi di un legame ad idrogeno intramolecolare che
impegnasse il gruppo carbonile risale alla fine degli anni ''80; vennero sintetizzati substrati β-lattamici N-
tiometilici in cui però il gruppo funzionale -SMe era inserito unicamente come gruppo protettore. Questo
gruppo funzionale era noto ed era generalmente utilizzato per proteggere le ammidi; mostrava stabilità a
vari pH (da 1 a 10), resistendo cioè a soluzioni di NaOH 2.5 N e H2SO4 10%. La rimozione veniva effettuata
con 2-piridin-tiolo e Et3N in CH2Cl2 26. L''interesse verso questa classe di biomolecole si è evoluto a causa della attività biologica mostrata soprattutto contro ceppi di Staphylococcus.
Il gruppo di ricerca del Professor Turos si è soffermato sulla sintesi e sulle proprietà antibatteriche di questi
derivati monobattamici N-tiometilati 27, (oltre che di derivati biciclici). Si individuarono soprattutto le proprietà chimiche che il gruppo -NSMe conferiva ai β-lattami; A) resistenza dell''intero substrato nei
confronti di molti nucleofili utilizzati in sintesi organica (CN -, N3-, alcoli) e biomolecole (come il glutatione o penicillanasi, proteina responsabile della degradazione della penicillina); B) carattere altamente lipofilo, che
provoca una scarsa solubilità nel mezzo acquoso, ambiente in cui però la maggior parte dei farmaci risulta
essere solubile; C) stabilità durante i processi di purificazione cromatografici.
Sono recentemente stati effettuati studi ab initio 28 comparativi tra l''N-tiometilazetidin-2-one e l''N- metossiazetidin-2-one per determinare analogie e differenze dei parametri strutturali dell''osso e del tio-
derivato. Le differenze riscontrate più evidenti sono; 1) le lunghezze di legame N-S e S-CH3 sono ovviamente
maggiori degli analoghi N-O e O-CH3 ('(NS/NO) = 0.335 ', '(SCH3 /OCH3) = 0.390 '); 2) l''angolo N'CH3 mostra che
il gruppo tiometilico tende ad essere ortogonale rispetto alla struttura ciclica, con un valore di 101.8 °
(N'CH3 = 110.8°); la conferma si ha dalla misura dell''angolo diedro tra il piano individuato dal β-lattame e il
legame SCH3, che è di 90.4° (108.7° per l''osso-derivato).

Struttura e spettro di azione degli N-tiometil β-lattami
La resistenza ai nucleofili e. Queste molecole si stanno classificando come antibiotici in grado di inibire
selettivamente la crescita di MRSA e Bacillus antrachis e hanno recentemente dimostrato di possedere
proprietà anticancerose e di non essere letali per cellule umane sane come i fibroblasti 17. La resistenza ai nucleofili e il carattere lipofilo portano a supporre che i meccanismi con cui questi substrati mostrano
attività biologica siano molto diversi da quelli degli altri β-lattami
Rimane ancora sconosciuto sia il target che il modo di azione di queste molecole, anche se i diversi studi
effettuati hanno permesso di fare ipotesi sui possibili meccanismi che intervengono.
Per mostrare l''importanza del gruppo SMe nell''evidenziare tutte queste peculiarità il professor Turos ha
confrontato l''attività di un N-tiometil β-lattame attivo (il primo della serie) con altri substrati β-lattamici
identici (stessa struttura e stereochimica dei sostituenti in C3 e in 4) con gruppi funzionali alternativi
sull''atomo di azoto.
26 Kessler, Iselin, Helv. Chem. Acta 1966, 49, 1330 27 a) E. Turos, M. Konaklieva, R. X. F. Ren, H. Shi, J. Gonzalez, S. Dickey, D. Lim, Tetrahedron, 2000, 56, 5571-5578; b)R. K. Mishra, K. D. Revell, C. M.
Coates, E. Turos, S. Dickey, D. V. Lim, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2006, 16, 2081-2083
28 Cz. Dobrowolski, J. Sadlej, A.P. Mazurek, Journal of Molecular Structure (TEOCHEM), 2004, 684, 181-186 22
N O H N O SCH3 N O SePh N O Cl N O SBz N O SO2Ph N O S-S N O SPh N O MeO MeO MeO MeO OMe MeO MeO MeO MeO Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph Ph Tutti i derivati ottenuti sono risultati inattivi, eccetto una debole attività riscontrata per il substrato S-
Benzilico.
Tutti gli studi effettuati su queste molecole nel corso degli anni hanno suggerito quali siano le
caratteristiche strutturali ottimali di questi derivati 14. 1) L''attività di questi composti è indipendente dai sostituenti presenti in C3 e in C4 e dalla loro
stereochimica; questa caratteristica è molto diversa rispetto alla reattività dei β-lattami non N-tiometilati,
per i quali invece i gruppi funzionali legati all''anello azetidinonico sono importanti soprattutto perché
possono fungere da siti di riconoscimento molecolare;
2) mostrano attività nonostante non possiedano un gruppo funzionale ionizzabile sull''anello (o nella
struttura biciclica, per strutture non monobattamiche) come molti gli altri β-lattami, che normalmente
possiedono ad esempio gruppi carbossilici;
3) si osservano variazioni di attività se si cambia il gruppo alchilico dello zolfo: l''attività biologica permane
con sostituenti arilici, ma è migliore con piccoli sostituenti alchilici fino a 4 atomi di carbonio. I risultati
migliori contro Staphylococcus aureus si hanno con sostituenti poco ramificati (isopropile, s-butile) mentre
quelli molto ramificati come il t-butile portano ad una drammatica caduta di attività. Lo stato di
ossidazione dello zolfo è importante: i gruppi N-sulfenici (NSR) e N-sulfinici (NS=OR) sono migliori rispetto ai
gruppi N-sulfonilici (NSO2R) e N-sulfonici (NSO3 -). Si può ipotizzare che l''attività di questi β-lattami sia sostanzialmente dipendente solo dal sostituente
sull''atomo di azoto, suggerendo che esso abbia un ruolo chiave nel meccanismo antibiotico. La tolleranza
verso i sostituenti all''anello azetidinonico suggerisce che la modalità di azione non coinvolga direttamente
un target biologico ben preciso, ma che possa in qualche modo influenzare la permeabilità della membrana
batterica e l''uptake cellulare, oltre che interferire con altri meccanismi. E'' stato recentemente effettuato
uno studio sulla attività biologica di N-tiometil 2-ossazolidinoni su ceppi di MRSA, 29 paragonandolo all''attività di un N-tiometil β''lattame di riferimento con struttura simile.
O N O SMe R' R' N O SMe R' R'
Esso ha mostrato che le molecole sono attive nei confronti dei ceppi batterici allo stesso livello del β-
lattame e questo porta a supporre che ciò sia dovuto soprattutto alla presenza del gruppo NSMe e non
unicamente alla struttura ciclica.
Il potere antibiotico degli N-tiometil β-lattami è stato testato non solo su batteri Gram-positivi come
Staphylococcus aureus ma anche su specie Gram-negative; nonostante alcune fluttuazioni i dati raccolti
erano consistenti e mostravano come microorganismi appartenenti a specie simili manifestassero gli stessi
livelli di suscettibilità a diversi substrati β-lattamici. L''azione di concentrazioni crescenti di queste molecole
su culture di MSSA (Methicillin-suceptible Staphylococcus aureus) e MRSA mostra che le popolazione 29 a) E. Turos, M. Konaklieva, R. X. F. Ren, H. Shi, J. Gonzalez, S. Dickey, D. Lim, Tetrahedron, 2000, 56, 5571-5578; b)R. K. Mishra, K. D. Revell, C. M.
Coates, E. Turos, S. Dickey, D. V. Lim, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2006, 16, 2081-2083 23
batteriche non diminuiscono, ma rimangono invece costanti. Il potere antibiotico appare esclusivamente
batteriostatico e non battericida.

Attività antibiotica degli N-tiometil β-lattami
L''attività di un antibiotico β-lattamico può essere potenzialmente messa in relazione con la reattività come
elettrofilo della stessa molecola. Se si effettua questo paragone e si studia la struttura di un ipotetico N-
tiometil β-lattame, si osserva che questo particolare substrato è suscettibile di attacco da parte di un
nucleofilo (che può far parte di una proteina o essere di natura strettamente chimica) su tre posizioni
differenti. Gli attacchi nucleofili possibili portano a queste tre differenti reazioni:
N O S R' R' Nu O R' N O R' R' N O R' R' Nu CH3 (1) (2) (3) N S R' Acilazione Alchilazione Tioalchilazione S + + NuSCH3 NuCH3 (1) (2) (3) CH3 La reazione di acilazione
La reazione di acilazione avviene tramite la formazione di un legame covalente tra il residuo di una serina
(Nu = -OH) del sito attivo di una PBP (penicillin-binding-protein) con formazione di un estere a catena
aperta. Il processo è generalmente coadiuvato dalla presenza di siti riconoscimento del β-lattame che
facilitano l''interazione con la proteina che lo idrolizza, e sostituenti sull''anello in grado di aumentare
l''elettrofilia e la reattività del carbonio ammidico. Come è stato sperimentato molti N-tiometil β-lattami si
sono dimostrati attivi pur non possedendo questo tipo di caratteristiche, e questo può far supporre che
queste molecole non abbiamo una reattività associata all''apertura dell''anello azetidinonico.

La reazione di alchilazione
Studi sperimentali in vitro per verificare una eventuale reazione di alchilazione di queste molecole hanno
rivelato che questa reazione pare non essere favorita. Non si spiegherebbe altrimenti la maggiore attività
biologica di specie con un gruppo alchilico sullo zolfo più grandi di quello metilico (R = Et, s-Bu), che sono
elettrofili peggiori essendo stericamente più ingombrati. L''ipotesi è stata anche verificata osservando
l''inefficacia del β-lattame nell''inibire la replicazione del DNA, prevedendone la possibile alchilazione a
livello degli atomi di azoto delle basi. Alcuni profarmaci come la leinamicina 30 e la mitomicina31 acquistano potere alchilante verso acidi nucleici dopo una reazione di attivazione mediata da un gruppo tiolico
presente nella matrice biologica (per esempio quello del glutatione o di un residuo di cisteina). Sono state
condotte quindi prove di denaturazione per alchilazione del DNA incubandolo con l''N-tiometil β-lattame e
agenti attivanti tiolici (glutatione, ditiotreitolo e β-mercaptoetanolo); anche in questo caso non si è
osservata alcuna reazione, e l''acido nucleico ha conservato la sua struttura terziaria. 30 Hara M., Takahashi I., Yoshida M., Asano K., Kawamoto I., Morimoto M., Nakano H. J., Antibiot, 1989, 42, 333
31 Hata, Hoshi, Kanamori, Matsumae, Sano, Shima, Suguwara, Antibiot. 1956, 9, 141 24

La reazione di tioalchilazione
La tioalchilazione sembra essere la reazione chimica più probabile di questi substrati. Essi si comportano
quindi come agenti che trasferiscono gruppi tiometilici, mostrando le stesse proprietà dei reagenti di
tioalchilazione uilizzati per sintetizzarli. Come già affermato in precedenza il legame N-S è molto stabile, ma
il gruppo funzionale risulta sensibile a nucleofili dal carattere fortemente tiofilo. Studi di incubazione dell''
N-tiometil β-lattame con Staphylococcus aureus con micro quantità del β-lattame mostrano la formazione
del derivato col gruppo NH libero e non idrolizzato con l''analisi all'' 1H NMR (manca il segnale diagnostico a circa 2.40-2.50 ppm) dopo estrazione con acetato di etile. Per determinare quale fosse il nucleofilo che
aveva reagito con il gruppo SMe, sono state effettuate prove di incubazione del β-lattame di riferimento
con i 20 aminoacidi normalmente contenuti nelle proteine, in condizioni fisiologiche. L''unica reazione che
ha portato alla detiometilazione è stata quella con la cisteina, che ha il gruppo ''SH come nucleofilo;
l''ipotesi è che la tioalchilazione avvenga sul residuo cisteinico di una proteina e che il risultato sia
l''inibizione della crescita del batterio. Successive prove di incubazione con altri metaboliti recanti funzioni
tioliche nucleofile hanno mostrato che il β-lattame reagiva anche con il glutatione.
HOOC H N N H COOH NH2 O O SH Glutatione (GSH) Questo risultato poteva suggerire che batteri con elevati livelli di glutatione citoplasmatico sapevano
resistere all''N-tio β-lattame disattivandolo e prevenendo l''attacco ad altri metaboliti e biomolecole cellulari,
primi tra tutti le proteine.

Per determinare invece il target di Staphylococcus aureus è stato effettuato un esperimento in cui un N-
alchiltio β-lattame collegato ad una resina veniva messo in incubazione per 24 ore con un lisato dello stesso
batterio.
S N O 24h con il lisato S SCoA
Dopo la purificazione della resina il risultato ha mostrato la formazione di un legame covalente con CoA;
questo risultato porta ad ipotizzare che batteri con elevate concentrazioni di questo cofattore siano anche
le più sensibili agli N-alchiltio β-lattami. In queste specie batteriche le concentrazioni di CoA sono molto
elevate. Esso è parte del tampone ossidoriduttivo citoplasmatico tiolico 32 assieme a NAD(P)H e FADH2; la sua funzione è quella di assorbire le specie reattive all''ossigeno generate dallo stress ossidativo cellulare.
32 delCardayre, Davies, Biol. Chem., 1998, 273, 5752 25

Le concentrazioni dei cofattori e l''equilibrio sono regolati dalla disolfuro reduttasi; l''ipotesi relativa
all''attività antibiotica degli N-alchiltio β-lattami è che essi formino un legame a ponte disolfuro con il CoA
oppure con amminoacidi presenti nei siti attivi delle proteine, molto probabilmente delle cisteine.
SH Enzima CoASH + N O S SSR Enzima CoASSR + NH O
L''ipotesi è supportata dal fatto che le specie batteriche in questione non possiedono elevati livelli di
glutatione, molecola in grado di reagire con l'' N-alchiltio β-lattame e bloccarne gli effetti antibatterici.
Un interessante paragone è il confronto tra la modalità d''azione degli N-alchiltio β-lattame con quelle
dell''allicina, 33 molecola contenuta nell''aglio di cui è sono state dimostrate le proprietà antibiotiche, oltre che antivirali, antifungali, antiparassitarie e anticancerose. S S O Allicina Questa molecola come gli N-alchil β-lattami mostra potere antibiotico soprattutto su batteri che non hanno
elevate concentrazioni di glutatione. Reagisce direttamente con residui tiolici di varie proteine, tra le quali
alcol deidrogenasi, tioredoxina reduttasi, e RNA polimerasi tramite la formazione di legami covalenti

1.2.1. Sintesi di nuovi N-tiometil monobattami come antibiotici contro ceppi resistenti presenti su
pazienti affetti da FC
34 Il gruppo di Ricerca presso cui ho svolto la tesi di Dottorato ha già in contribuito in maniera significativa alla
sintesi di monobattami, in particolare con la scoperta del nucleo 4-alchiliden β lattamico, attivo contro
ceppi batterici resistenti.
In questi azetidinoni, per i quali è stata messa a punto una sintesi molto accurata, è presente un doppio
legame in posizione 4 coniugato ad una funzionalità esterea. Questo porta il carbonio carbonilico ad essere
molto elettrofilo a e favorire così l''attacco nucleofilo del residuo amminoacidico della transpeptidasi
batterica, seguendo il ''modello inibitorio' tipico dei monobattami.
33 a) Cavallito, Bailey, J. Am. Chem. Soc., 1944, 66 1944; b) Ankri, Mirelman, Microbes Infect, 1999, 2, 125; c) Block, Scient. Am., 1985, 252, 94
34 P. Galletti, C. Cocuzza, R. Musumeci, M. Pori, A. Quintavalla, D. Giacomini, ''Antibiotics and Cystic Fibrosis: Synthesis and antimicrobial evaluation
of a series of N-thiomethyl-azetidinones', Chem Med Chem, 2011, 6, 1919-1927 26
NR O OR' O Nu NR O OR' O Nu NR O OR' O Nu NR O OR' O Nu
Il doppio legame in posizione 4 consente infatti la stabilizzazione del prodotto di apertura dell''anello β''
lattamico tramite la delocalizzazione della carica per risonanza all''interno del sistema insaturo.
Ulteriori funzionalizzazioni hanno riguardato l''introduzione di gruppi sull''azoto β''lattamico 35 e l''inserimento di particolari funzioni in posizione 3 sui 4-alchilideni. 36 L''attività antibatterica dei 4-alchiliden- β-lattami è stata valutata dal gruppo di ricerca della Prof. Cocuzza dell''Università di Milano Bicocca ini vitro
tramite studi di MIC. I ceppi batterici utilizzati comprendono specie Gram-positive e Gram-negative. Tra i
Gram-positivi gli Streptococcus Pyogenes, sensibili o resistenti all''eritromicina, Pneumococchi sensibili e
resistenti alla penicillina, Staphylococcus Aureus sensibile e resistente alla meticillina. Tra i Gram-negativi ci
sono ceppi ad elevata resistenza e ceppi produttori di β-lattamasi e non.
Tabella 1 MIC Composto S. Pyog. S. Pneum. MRSA MSSA S. Epiderm. H. Infl NH COOBn O Cl (A) 32 128 16 8 8 1 NH COOH O Cl (B) 16 128 128 32 64 64 NH COOBn O O O MeO MeO OMe (C) 128 >128 128 8 4 >128 NH COOBn O O O MeO HO OMe (D) 128 128 32 16 2 64
Gli incoraggianti risultati ottenuti dai test di attività biologica (Tabella 1) hanno portato allo studio di
ulteriori modifiche alle strutture 4-alchilideniche, in particolare alla sintesi di 4-alchiliden-β-lattami
caratterizzati dal gruppo tiometile (-SMe). Sono poi stati sintetizzati altri β lattami con la presenza in 4 di un
gruppo elettron attrattore e sempre N-Tiometilati. Tutti questi β lattami schematizzati sono stati sintetizzati
e testati ed è stata paragonata la loro attività agli analoghi non tiometilati

35 G. Cainelli, D. Giacomini, P. Galletti, A. Quintavalla, Tetrahedron Letters 2003, 44, 6269-6272
36 F. Broccolo, G. Cainelli, G. Caltabiano, C. E. A. Cocuzza, C. G. Fortuna, P. Galletti, D. Giacomini, G. Musumarra, R. Musumeci, A. Quintavalla, J. Med.
Chem., 2006, 49, 2804-2811 27
.
I 4 alchiliden β lattami sono quindi stati sintetizzati tramite un protocollo noto e ben conosciuto, partendo
dai due substrati commerciali 16 (3R,4R)-4-acetossi-3-[(1R)-1-(tert-butildimetilsililossi)etil]azetidin-2-one)

e 28 (4-acetossiazetidin-2-one) con etil o benzil diazoacetato, ottenendo quindi i composti 1, 3, 5, 7, 8, and
9.
I diastereoisomeri E e Z di ciascun 4-alchilidene sono stati facilmente separati con flash cromatografia. Si è
poi proceduto con la tiometilazione, che è stata possibile solo sull''isomero E con LDA o con LiHMDSA e
successive addizione di of S-metil metantiosulfonato per ottenere i composti 2, 4, and 6. Ogni tentativo di
N-tiometilare l''isomero Z (anche con altre basi quali NaH, tbutOK e temperature più elevate) è fallito. N O H O R R' OR'' > 8.5 ppm N O H R R' < 8. 0 ppm O OR''
La difficoltà nel derivatizzare l''azoto nell''isomero Z è la presenza di un forte legame ad idrogeno tra
l''ossigeno dell''estere e l''idrogeno NH del β lattame, come testimoniato dal chemical shift all''NMR e dai
raggi X. NR 1 O COOR OTBS N O OTBS COOEt NH O COOR 15 SMe NR 1 O COOR N O COOBn OH SMe N O COOBn O SMe O HO N O COOBn O SMe O HO MeO OMe NR 1 O COOEt 13 12 1: R = Et, R 1 = H 2: R = Et, R 1 = SMe 3: R = Bn, R 1 = H 4: R = Bn, R 1 = SMe 5: R = Et, R 1 = H 6: R = Et, R 1 = SMe 7: R = Bn, R 1 = H 8: R = Et
9: R = Bn 10: R 1 = H 11: R 1 = SMe NR 1 O OAc OR 2 16: R 1 = H, R2 = TBS 17: R 1 = SMe, R2 = TBS 18: R 1 = H, R2 = H 19: R 1 = SMe, R2 = H NR 1 O SAc OR 2 20: R 1 = H, R2 = TBS 21: R 1 = SMe, R2 = TBS 22: R 1 = H, R2 = H 23: R 1 = SMe, R2 = H NR 1 O SO2Ph OR 2 24: R 1 = H R2 = TBS 25: R 1 = SMe R2 = TBS 26: R 1 = H R2 = H 27: R 1 = SMe R2 = H NR 1 O OAc 28: R 1 = H 29: R 1 = SMe NR 1 O SAc 30: R 1 = H 31: R 1 = SMe NR 1 O SO2Ph 32: R 1 = H 33: R 1 = SMe 14 NH O COOR NH O COOR + NH O R' OAc R' R' N O COOR R' ref.11 a SMe 8,9 1,3,5,7 16,28 2,4,6 R' = H, CH(OTBS)CH3
R = Et, Bn 28
Successivamente, il derivato N-tiometilato 4 è stato ulteriormente derivatizzato con esteri fenolici, previa
deprotezione del gruppo tertbutil dimetil silile presente sulla catena idrossi etilica con BF3-OEt2 (13) seguita
dal trattamento del relative cloruro acido arilico in presenza di SnCl4 (5%) ottenendo I β lattami 14 e 15.
Per verificare l''effetto del gruppo 4 alchilidenico, sono stati sintetizzati I composti 11 e 12, in cui come il
doppio legame C=C è stato sostituito da un legame saturo. La sintesi è stata effettuata tramite
idrogenazione catalitica di 1 e 5 e successiva N-tiometilazione.
Abbiamo poi sintetizzato una seconda serie di azetidinoni N-
tiometilati in cui in 4 era presente un gruppo elettron
attrattore: sono stati ottenuti derivati del 4-acetato, 4-
tioacetato e 4-benzensulfinato. I 4-Thiocetossi e I 4-SO2Ph
sono stati facilmente ottenuti dai 4-acetossi azetidinoni
commerciali tramite reazioni di sostituzione nucleofila. 14
I tioacetossi sono stati ottenuti utilizzando il tioacetato di
potassio, mentre i 4-SO2Ph con il benzensulfinato di sodio. E''
interessante notare come siano state necessarie procedure di
sostituzione nucleofila differenti per il substrato 16 e per il 28.
Sono state poi effettuate ulteriori elaborazioni quali la N-
tiometilazione (composti 17, 29, 21, 25, 31, e 33) e la
rimozione del TBS (19, 23, and 27) con le procedure già note.


Analisi Saggi di attività antibatterica
Su tutti i composti sintetizzati sono state effettuate le saggi
di attività su ceppi batterici resistenti Gram-positivi e Gram-
negativi: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, N O COOBn OTBS SMe N O COOBn OH SMe 13 4 a b N O COOBn O SMe 14,15 Aryl O NH O COOEt N O COOEt SMe NH O R' OAc R' R' ref. 13 b 16,28 10: R = H 11,12 R' = H, CH(OTBS)CH3 NH O R' OAc 16,28 NH O R' R N O R' R 21,25, 31,33 SMe 20,24,30,32 N O R' OAc 17,29 N O OTBS SMe N O OH SMe 19,23,27 17,21,25 ref.14 R' = H, CH(OTBS)CH3
R = SAc, SO2Ph R a SMe a b R R = OAc, SAc, SO2Ph 29
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenzae,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, e Serratia marcescens.
Nella tabella sono descritte le attività biologiche dei composti che hanno mostrato la migliore attività
antimicrobica espressa in un range di minima concentrazione inibente
(MICs, in mgL -1) assieme alla minima concentrazione inibente la crescita del 50 e 90% del microorganismo (MIC50 and MIC90, rispettivamente). In particolare sono stati inseriti solo I risultato che mostravamo valori di
MIC compresi tra 31 e 1 mg/L almeno su di una specie batterica. Non sono quindi mostrati dati relativi alle
molecole che non hanno mostrato alcun segno di attività.
Dai risultati si osserva una attività biologica promettente contro alcuni ceppi batterici Gram-Positivi per
alcuni NH e NSMe monobattani.
Per quanto riguarda i 4 alchilideni, gli N-tiometili 2 e 4 hanno mostrato attività contro ceppi di S.Aureuss
(MSSA) et (MRSA). In particolare per il composto 4 la migliore attività è contro S. pyogenes (MIC range: 4''8
mg/L). I risultati per i corrispondenti NH 4 alchilideni testati in precedenza hanno mostrato l''inattività del
composto 1 e una certa attività del composto 3 su ceppi Gram-positivi; (MIC range: 16''32 mg/L contro.
pneumoniae). I 4 alchilideni polifenolici non sono mostrato in quanto sono risultati del tutto inattivi. Per
quanto riguarda la sostituzione in C3, i 4 alchilideni 7 e 9 hanno mostrato solo una attività modesta contro E.
Coli mentre il composto 6, N-tiometilato, è del tutto inattivo. Anche I composti 10,11 e 12, gli analoghi
saturi dei 4 alchilideni, sono risultati inattivi. Tra la serie dei 4 acetossi derivati, il composto 17 ha mostrato
attività contro MSSA, MRSA, e S. epidermidis. L''analogo 29 C3 non sostituito ha mostrato una diminuzione
della attività contro MSSA, MRSA, E. faecalis, e E. coli. I derivati 4-benzensulfonici hanno mostrato una
attività molto bassa con una certa attività solo per i composti 25,27 e 33 (MIC range of 64''128 mg/L contro
MSSA, MRSA, S. pyogenes, and E. col).
I derivati 4-tioacetato 22, 23, 30, and 31, hanno mostrato una interessante attività soprattutto contro
specie Gram-positive
Successivamente, le migliori molecole in termini di attività antibatterica sono state testate ulteriormente su
ceppi batterici MSSA e MRSA isolati da pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica.
I composti 30 e 31 hanno mostrato la stessa attività mentre per i composti 4 e 17 si è osservato un
interessante incremento della attività contro S. Aureus. In particolare il composto 17 ha mostrato un
incremento nella attività anche contro isolati di MRSA e MSSA.E'' stata successivamente misurata la minima
conentrazione battericida (MBC) e il rapporto MBC/MIC maggiore di 4 per i composti 4, 17, 30 e 31
sembrano caratterizzare l''attività biologica di questi monobattani come batteriostatica contro MSSA e
MRSA.
I buoni risultati ottenuti hanno ci hanno spinti a costuire un modello preliminare di SAR per comprendere e
caratterizzare i fattori strutturali determinanti per l''attività biologica. Per quanto riguarda i 4-alchilideni
sembra importante la combinazione tra il gruppo N-tiometile e il benzil estere, con la conseguente
maggiore attività biologica contro ceppi batterici Gram-positivi. L''assenza di un sostituente sul C3 sembra
conferire una attività specifica contro S. pyogenes e aumentarla invece contro E.Coli, anche se in modo
modesto, per i composti 7 e 9. La presenza di un gruppo polifenolico al C3 causa una diminuzione della
attività antibatterica. Quindi sfortunatamente, combinando un estere fenolico con un gruppo N-tiometile si
ha l''inattivazione dellattività biologica. Per quanto riguarda la serie dei 4 acetossi, i composti 17, 19 e 29
chiaramente vedono una attività migliorata sicuramente per via del gruppo N-tiometile.
Paragonando i 4-OAc, 4-SAc, and 4-SO2Ph, i 4-Sac hanno mostrato la migliore efficienza; in particolare per
questi derivati, la presenza del gruppo N-tiometile non ne migliora l''attività biologica. Come già affermato
in precedenza, Turos e i colleghi hanno tentato di comprendere il meccanismo di azione dei derivati N-
tiometilici
L''ipotesi è che il gruppo tiometilico venga trasferito dal β lattame ad un determinate target cellulare. Il
target sembra possa essere il Coenzima A (come appare da studi in ''vitro') e da questo punto di vista gli N-
tiometil β lattami sembrano caratterizzarsi come ''profarmaci' . In questa visione sembra quindi che
l''attività biologica non necessiti di particolari requisiti da parte della struttura β lattamica, che funziona
quindi semplicemente come ''carrier di gruppi tioalchilanti', causando non un effetto battericida ma
batteriostatico. Osservando in particolare quindi che i monobattami 4, 17, e 31 mostrano una attività
batteriostatica, si può asserire che il meccanismo di azione sia quello di agenti tiometilanti come afferma 30
Turos. In ogni caso il β lattame 30, non N-tiometilato, ha mostrato una considerevole attività contro ceppi
Gram-positivi e Gram-negativa. Questo aspetto associato alla attività comunque mostrata da monobattami
non tiometilati mostra che in effetti il gruppo tiometilico non sembra essere essenziale per l''attività
biologica, anche se può avere un ruolo nell''aumentare complessivamente la lipofilia e quindi la
penetrabilità nella membrana. In ultima analisi, le attività antibatteriche simili mostrate contro MRSA e
MSS suggeriscono che la PB17 (penicillin binding protein 2) non rappresenta un target specifico per questi
monobattami.

1.2.2 N-tiometil monobattami ad attività duale 37 La fibrosi cistica, come è stato descritto in precedenza, causa al sistema polmonare uno stato di infiammazione
cronica e costante anche in assenza di una infezione batterica. In queste condizioni sia i neutrofili che le cellule
epiteliali rilasciano nello spazio extracellulare alte concentrazioni di specie reattive all''ossigeno (ROS) e
all''azoto (RNS) con l''obiettivo di attaccare ed eliminare gli agenti patogeni. 38 Nei pazienti affetti da fibrosi cistica questo meccanismo di difesa si dimostra essere assolutamente inefficace e progressivamente porta alla
disfunzione cellulare e a una accelerazione della malattia. 39 Quindi, la presenza dello stress ossidativo causato dall''incremento delle specie reattive all''ossigeno e ad un loro stato di non bilanciamento, in particolare
durante uno stadio di infezione polmonare cronica, porta alla luce nuovi target che contrastino queste
molecole. 40
Lo stress ossidativo: i ROS e i RNS
L''acronimo ROS e RNS significa specie reattiva all''ossigeno e all''azoto, normalmente specie di natura
radicalica. I radicale libero è qualsiasi specie chimica contenente uno o più elettroni spaiati: questo
conferisce loro una particolare reattività e pota la molecola ad acquistare elettroni ricercando stabilità
attaccando altre molecole.
I radicali liberi si possono originare attraverso due processi:
1) rottura omolitica di un legame
2) trasferimento di un singolo elettrone da una specie ad un'altra.
La rottura omolitica di un legame può avvenire per assorbimento di energia sotto forma di radiazione
elettromagnetica o di calore.
Il trasferimento monoelettronico, invece, porta alla formazione di un radicale catione e di un radicale
anione, specie caratterizzate dalla presenza sia di un elettrone spaiato che di una carica elettrica.
Il corpo umano è continuamente soggetto all''attacco dei radicali liberi i quali, oltre ad essere ritenuti
responsabili del processo d''invecchiamento, sono anche implicati nell''insorgenza di patologie molto gravi:
tra cui si annoverano le malattie cardiovascolari, ritenute la principale causa di morte nei paesi occidentali.
Alcuni studi hanno indicato i radicali liberi come concausa di danni a livello epatico e renale, della cataratta,
di disturbi polmonari, neurologici, sessuali, nonchè di alcune forme neoplastiche.
Oltre ai danni cardiovascolari, si è ipotizzato che lo stress ossidativo possa favorire anche l''insorgenza di
patologie neurodegenerative quali il morbo di Parkinson e la malattia di Alzheimer.
Fattori ambientali e nutrizionali, come le radiazioni (raggi X, raggi γ, UV), gli inquinanti atmosferici (ozono,
N2O2, NO2, fumo di sigaretta, ecc.), una dieta povera di frutta e verdura, di acidi grassi poliinsaturi e
vitamine antiossidanti, possono incrementare l''attività dei sistemi generanti i ROS, inducendo lo stress
ossidativo.
La produzione di specie radicaliche non è solo da ricondurre all''esposizione a xenobiotici esterni
(irraggiamento, inquinanti aerei, agenti chimici), ma anche al metabolismo umano, che essendo aerobio, è
concentrato necessariamente sull''ossigeno. 37 R. Cervellati, P. Galletti, E. Greco, L. Bardini, F. Paolucci, M. Pori, Daria Giacomini, ''Monocyclic β- Lactams as antibacterial agents: Facing
antioxidant activity of N-thiomethyl-azetidinones', Europ. Journ. of Medicinal chemistry, 2013, 60, 340
38 a) G. Folkerts, J. Kloek, R.B. Muijsers, F.P. Nijkamp, Eur. J. Pharmacol. 429, 2001, 251''262; b) M.C. Martınez, R. Andriantsitohaina, Antioxid.
Redox Signal. 11, 2009, 669''702 39 M. Rottner, S. Tual-Chalot, H.A. Mostefai, R. Andriantsitohaina, J.M. Freyssinet, M.C. Martinez, PLoS One 6, 2011, e24880, DOI:
10.1371/journal.pone.0024880
40 P.'. Jense, J. Lykkesfeldt, T. Bjarnsholt, H.P. Hougen, N. Høiby, O. Ciofu, Basic Clin. Pharmacol., 2012, Doi: 10.1111/j.1742-7843.2011.00822.x 31
Le specie reattive all''ossigeno (ROS) e all''azoto (RNS) sono normalmente prodotte in ogni cellula
dell''organismo umano, come risultato della riduzione dell''ossigeno ad acqua a livello della catena
respiratoria mitocondriale.
Lo squilibrio tra la produzione di ROS e RNS e la capacità antiossidante cellulare in favore delle specie
radicaliche, causa lo stress ossidativo che contribuisce all''insorgenza di numerose patologie, risultanti dai
danni provocati dall''ossidazione delle proteine, del DNA e della perossidazione lipidica.
I radicali liberi che rivestono maggiore importanza negli organismi viventi sono quelli centrati sull''ossigeno
(ROS) e si possono dividere in: - radicali molto reattivi, come l''ossidrile HO' e gli alcossili RO', che attaccano molecole di qualsiasi tipo,
- radicali moderatamente reattivi, quali l''anione superossido O2 '', l''idroperossile HOO' ed i perossili ROO' che reagiscono solo con poche molecole biologiche (ad esempio i lipidi poliinsaturi), ma sono capaci di
originare perossidi ed idroperossidi, precursori sia del radicale ossidrile che degli alcossili estremamente
reattivi.
I ROS coinvolti nello stress ossidativo sono in prevalenza specie radicaliche, ma possono essere anche
specie non radicaliche ad azione ossidante, come il perossido di idrogeno H2O2 e l''acido ipocloroso HOCl.
Tuttavia, oltre ai ROS anche altri radicali possono essere potenzialmente dannosi per l''organismo. Gli antiossidanti esogeni ed endogeni sono indispensabili per il mantenimento dell''equilibrio ossido-
riduttivo fra radicali liberi ed antiossidanti.
Gli antiossidanti enzimatici endogeni come la superossido dismutasi, la catalasi e la glutatione perossidasi, e
quelli non enzimatici esogeni ed endogeni come il glutatione, la vitamina C, la vitamina E ed il β-carotene
''detossificano' i ROS e i RNS minimizzando i danni causati alle molecole biologiche.
Gli enzimi sono antiossidanti endogeni poiché prodotti dall''organismo umano, mentre le vitamine e il β-
carotene sono antiossidanti esogeni in quanto l''organismo non è in grado di sintetizzarli e devono essere
assunti con la dieta. Per quanto riguarda gli antiossidanti esogeni, i polifenoli sono un''importante categoria
di sostanze di origine naturale contenuti nelle piante, di cui sono principalmente metaboliti secondari (sono
detti anche biofenoli) e suddivisibili in due grandi classi: flavonoidi e acidi fenolici. In particolare il mio
gruppo di ricerca in passato si è occupato di sintetizzare 4-alchiliden β lattami coniugati a strutture
polifenoliche, osservando che l''attività antiossidante riconducibile al substrato fenolico veniva conservata. 41
Visti gli ottimi risultati in termini di attività biologica in vitro degli N-tiometil 2 azetidinoni contro isolati clinici
Gram-positivi e Gram-negativi e in particolare su ceppi di MRSA e MSSA isolati da pazienti affetti da fibrosi
cistica, le migliori strutture β lattamiche testate e qui sotto rappresentate sono state opportunamente
derivatizzate sulla catena idrossi etilica con una catena polifenolica per ''aggiungere' a queste molecole anche
un substrato che potesse fungere da antiossidante.
Le nuove molecole sono poi stati effettuati test di attività biologica su ceppi batterici presenti su pazienti
affetti da fibrosi cistica e test di attività biologica per verificare la potenziale capacità in vivo di intercettare
speci ROS e RNS.
Le nuove molecole sintetizzate dovrebbero avere la caratteristica di essere sia antibiotiche che antiossidanti,
acquisendo quindi un''attività duale.
41 G. Cainelli, C. Angeloni, R. Cervellati, P. Galletti, D. Giacomini, S. Hrelia, R. Sinisia, Chemistry & Biodiversity , 5 (2008) 811 32
N O O O MeO O OMe N O O O MeO HO OMe OAc OAc O N O O O HO HO OAc SMe SMe SMe N O O O HO HO OAc SMe NH O OTBS O S N O OTBS COOBn SMe N O OTBS SMe OAc N O OH SMe OAc N O SMe OAc N O SO2Me OAc NH O OTBS SAc NH O OH SAc NH O SAc N O SAc SMe N O SMe 38 35 36 37 22 39 40 30 31 34 4 17 19 29 20
Le 15 molecole qui sopra rappresentate sono state tutte sintetizzate e testate. Le molecole 4, 17, 19, 29, 20, 22,
30, 31, e 34 sono state preparate secondo procedure di letteratura già note *10,16+. L''N-metilsofossido-4-
acetossi-azetidin-2-one 36 è stato preparato a partire dal β lattame commerciale trattandolo con LiHMDSA e
poi MsCl. In maniera analog ail β lattame 35 è stato ottenuto trattando l''azetidin-2-onecommerciale con
LiHMDSA e poi S-metilmetansulfonato (Scheme 1). N O SO2Me OAc N O SMe 35 36 NH O OAc NH O THF, -78° C THF, -78° C 1)LiHMDSA 2) MeSO2SMe 1)LiHMDSA 2) MsCl I composti 37-40 sono stati preparati dal susbtrato commerciale 16. Il composto 16 è stato inizialmente N-
tiometilato utilizzando una nuova procedura messa a punto da noi usando Et3N invece di LiHMDSA o LDA per
limitare la formazione di sottoprodotti. Il β lattame 17 è stato poi deprotetto dal gruppo TBS dando 19 e
trattato successivamente con il relativo acido benzoico O-protetto 44, 46, e 47 in presenza di DCC o EDC come
reagenti di coupling e quantità catalitiche di DMAP in dichloromethane ottenendo infine i composti 37, 41 e 42.

33
Per quanto riguarda gli acidi benzoici, è risultato fondamentale proteggerli in quanto il processo di coupling
con un gruppo fenolico libero porta alla formazione di dimeri e processi di omocoupling. L'' acido metil 4-
(etossimetossi)-3,5-dimetossi benzoico 44 e l''acido (E)-3-(3,4-bis(etossimetossi)fenil) acrilico 46 sono stati
preparati dal metil estere dell''acido siringico e dal metil estere dell''acido caffeico, tramite protezione del
gruppo fenolico con clorometil etil etere e successiva idrolisi alcalina del gruppo estereo di 43 and 45. Infine I
composti 37 e 42 sono stati trattati con acido trifluoroacetico per eliminare la protezione fenolica e ottenere
quindi I prodotti 38 e 40. La stessa procedura applicata all''acido 3,4 diirdossi benzoico non è stata efficace per
l''ottenimento di 39; è stata scelta una strategia di protezione con dei gruppi TBS, con l''ottenimento del β
lattame 41. Attività antiossidante
L''attività antiossidante degli azetidinoni sintetizzati è stata verificata tramite quattro diversi protocolli che
tengono conto dei differenti meccanismi potenziali con cui l''ossidazione può intervenire. 42 42 K. Schlesier, M. Harwat, V. Böhm, R. Bitsch, Free Radic. Res. 36, 2002,177-187 34
Il primo approccio sfrutta l''azione inibitoria di un antiossidante di radicali liberi nei confronti della reazione
oscillante di Briggs''Rauscher (BR) a pH 2.2. In Una reazione chimica si dice oscillante quando le
concentrazioni dei reagenti e dei prodotti oscillano nel tempo senza l''intervento di fattori esterni. La
reazione di Brigg-Rauscher può essere così schematizzata: IO3 '+ 2H 2O2 + CH2(COOH)2 + H + ' ICH(COOH)2 + 2O2 + 3H2O La reazione procede tramite intermedi ionici e radicali, e tra le specie radicali quelli presenti in maggior
concentrazione sono i radicali idroperossili HOO '. Sostanzialmente quando degli ''scavenger' radicalici sono addizionati ad una miscela attiva di BR si assiste ad uno spegnimento istantaneo della reazione, un tempo
di inibizione che dipende linearmente dalla concentrazione dell''antiossidante cui segue poi una ripresa
delle oscillazioni. 43 Il secondo approccio utilizzato per valutare l''attività antiossidante è stato il metodo TEAC. Il metodo si basa
sulla decolorazione del radicale catione blu-verde dell''ABTS '+ per opera di antiossidanti, 44 che viene preformato con K2S2O8 in tampone fosfato a pH 7.4 (il pH del sangue, per mimare le condizioni fisiologiche). Si
effettuano poi misure spettroscopiche in triplicato a 734 nm a quattro concentrazioni di antiossidante in
DMSO. Con la stessa metodologia si preparano allo stesso modo soluzioni diluite di Trolox, che viene utilizzato
come standard.La differenza di assorbanza tra il bianco (solo DMSO) e il campione fornisce un 'E6 (E6blank-
E6sample = 'E6). In queste condizioni sperimentali il valore di 'E6 plottato contro la concentrazione segue la
legge di Lambert Beer. L''attività antiossidante è data dal rapporto m(smp)/m(std), m = pendenza della linea
dritta, ed è riportata come millimoli di equivalenti di Trolox.
Il test DPPH si basa sulla decolorazione del radicale stabile 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH ') per opera di antiossidanti. 45Il radicale DPPH' è colorato intensamente di rosso (λmax = 515 nm). La sua decolorazione è una funzione della concentrazione e del tempo e anche in questo caso si usa Trolox come standard. La relativa
attività antiossidante è quindi ottenuta tramite il paragone tra la retta relativa alla percentuale di inibizione
plottate rispettivamente in relazione alla concentrazione di Trolox. Si riportano poi I dati come mMoli di
equilvaneti di Trolox.
L''ultimo metodo utilizzato è il FRAP,come descritto da Benzie e Strain, che misura l''attività antiossidante come
la capacità di ridurre lo ione Fe 3+.46 La procedura si basa sulla riduzione del complesso incolore 2,4,6-Tris(2- piridil)-s triazin-Fe 3+, (TPTZ)2Fe3+ a quello blu 2,4,6-Tris(2-piridil)-s triazin-Fe2+ per oper di antiossidanti. Vengono testae quattro o cinque concentrazioni diverse di antiossidante a 593 nm confrontanto l''assorbanza
plottata contro la concentrazione relativa allo standard (FeSO4) ottenendo infine un valore misurato in mM
equivalenti di Fe(II).
La maggiorparte dei β lattami testati non ha mostrato una significativa attività antiossidante con i metodi TEAC
(Tabella 2), DPPH or FRAP. In più i composti 4, 17, e 31 sono stati anche testati con il reagente di Folin-
Ciocalteu (FC, chiamato anche il metodo dell''acido gallico equivalente) per verificare l''attività riduttiva dello
scheletro dell''N-tiometil β lattame, ma con risultati negativi. Anche i composti 22 e 30 non sostituiti sono
risultati essere negativi ai test di attività antiossidante. Solo gli N-tiometil β lattami 37-40, con esteri fenolici
sulla catena idrossi etilica, sono risultati attivi.











43 R. Cervellati, K. Höner, S.D. Furrow, F. Mazzanti, F. S. Costa, Helv. Chim. Acta 87, 2004, 133-155
44 a) R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, C. Rice-Evans, Free Radic. Biol. Med. 26, 1999, 1231-1237; b) A.Prakhash, F. Rigelhof, E.
Miller, Antioxidant Activity, www.medlabs.com/Downloads/Antiox_acti_.pdf
45 M.S Blois, Nature 181, 1958, 1199-1200, W. Brand-Williams, M.E. Cuvelier, C. Berset, Lebensm. Wiss. Technol/Food Sci. Technol. 28, 1995, 25-30
46 I.F.F. Benzie, J.J. Strain, Anal. Biochem. 239, 1996, 70-76 35
Tabella 2 Comp BR (µM eq. Resorcinol) TEAC (mmol eq. TROLOX) DPPH (mmol eq. TROLOX) FRAP (mmol eq.Fe) Attività antimicrobica su MRSA da CF a MIC range (mg/L) MIC50 (mg/L) MIC90 (mg/L) 19 na b na na na 32->128 64 >128 29 na na na na 32-64 32 64 22 na na na na 16-128 64 128 30 na na na na 16-64 32 64 31 na na na na 16-32 16 32 37 0.70 c na neglegibile na nd b nd nd 38 1.8 ± 0.3 0.037 ± 0.001 0.0091 ± 0.0002 0.19 ± 0.02 16-128 64 128 39 0.38 ± 0.02 1.23 ± 0.02 1.96 ± 0.13 1.91 ± 0.07 32->128 128 >128 40 1.95 ± 0.06 0.98 ± 0.03 1.23 ± 0.03 1.98 ± 0.04 16-128 64 64 FOT e 1->128 128 >128 CTX e 1->128 8 >128 a Le colture di S. aureus American ATCC 29213, and ATCC 43300 sono state usate come controllo. b na = nessuna attività; nd = non determinato.
c risultato di una sola misura in una miscela a concentrazione 14.7 M. I valori di TEAC per I composti 39 e 40 sono in linea con quelli di β lattami polifenolici riportati in articoli
precedent, attestandosi tra gli 0.40 e i 2.0 mM di Trolox. I metodi DPPH e FRAP sono sonstanzialmente in
accodro con o valori ottenuti dal TEAC, considerando comunque la differente chimica di entrambi I metodi.
Infatti per confronto, i valori di TEAC per l''acido Ascorbico (Vitamina C) e l''-Tocoferolo (Vitamina E) sono
1.05 e 0.97 rispettivamente, i valori di DPPH sono 1.1 e 0.5, mentre il valore FRAP per le due vitamine è 2.0. Come atteso il composto 37 non mostra attività antiossidante con questi tre metodi (controllo negativo) in
quanto non contiene gruppi OH liberi, essendo protetto come etere. Il composto 13 si dimostra essere un
composto con una attività antiossidante molto bassa ma tramite studi SAR si può tentare di interpretare il
risultato.
I valori BR per tutti I composti sono soprendentemente più alti rispetto a quelli sui β lattami polifenolic
riportati in precedenza, attestandosi tra 0.021 e 0.28 0.28 μM eq. di Resorcinolo. Il sospetto è che questi risultati inusuali possano essere dovuti ad una ossidazione dello solfo del gruppo N-tiometle per opera dello
iodato acido che compete con la reazione di ''scavenging' del radicale HOO '. E ovviamente sui susbtrati non N-tiometilati la reazione non può avvenire.

Relazione struttura-attività
In generale il potere antiossidante si rivela per quelle molecole in cui sono presenti uno o più gruppi OH liberi
sulla catena fenolica. 47 Wright ha riportato un modello teorico per calcolare le entalpie di dissociazione di legame (BDE) per quelle molecole appartenenti alla classe dei fenoli per correlarlo poi con la loro attività di
''scavengers' radicalici. GLi stessi autori dicono che per determinare il potere antiossidante di ciascun gruppo
OH (e quindi la BDE) di una molecola polifenolica bisogna prendere in considerazione in maniera additiva i
seguenti elementi: l''elettronica i legami a idrogeno e gli effetti dei sostituenti. In questo modo il valore di BDE
o 'BDE = (BDEcomp - BDEΦ-OH) può essere semplicemente calcolato dai dati riportati per ciascun polifenolo. Si è
osservato che il numero di gruppi OH non è così importante e che risulta strategica la loro posizione rispetto
agli altri sostituenti a determinarne l''attività e la forza antiossidante. Dai dati riportati in tabella 1 abbiamo
calcolato i valori di 'BDE per l''acido siringico A e l''acido 3,4 diidrossi benzoico B paragonandola all''attività di
scavenging radicalica dei 13 e 14.
47 C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, Free Radic Biol. Med. 20, 1996, 933-956 36

Come si vede dalla figura il modello costruito si A e B si adegua molto bene ai dati sperimentali, giustificando
anche la bassa attività antiossidante di 38 rispetto a 39.

Voltammetria
Per intepretare il ruolo nell''attività antiossidante dell''atomo di zolfo di questi β-lattami sono stati fatti studi di
voltammetria ciclica. E'' infatti ben noto che I tioeteri possono ossidarsi a solfossidi e posi a solfoni in H2O2 o
con altri agenti ossidanti. 48 I primi risultati dei test antiossidanti però sembrano mostrare che il gruppo N- tiometile non sembra essere disposto ad ossidarsi. Sono quindi stati effettuati studi di voltammetria ciclica
partendo dai composti 30 e 31, scelti come modello. Nella prima molecola l''atomo di zolfo bivalente è legato
al carbonio C4 mentre nella seconda all''atomo di azoto dell''anello β-lattamico. Lo scopo è di misurare l''abilità
di questi composti modello di venire ossidate per valutare la loro attività antiossidante tramite la misura del
potenziale standard corrispondente. Per avere una migliore interpretazione dei dati abbiamo anche effettuato
la voltammetria ciclica del derivato 34, che aveva mostrato una attività antibiotica nulla ma che era risultata
antiossidante in maniera modesta nei test BR e TEAC (condizioni acidi e neutre rispettivamente) che può
essere spiegata, visto il profilo del voltammogramma, cone la formazione di un radical catione intermedio
R2S '+.




48 M.B. Smith, J. March, March''s Advanced Organic Chemistry, Wiley Interscience New Jersey 2007, ch. 19, p. 1780 37
Anche le specie 30 e 31 hanno mostrato in MeCN un profilo voltammografico simile nella regione del
potenziale positivo con un grande picco anodico a circa 0.9 V attribuibile alla ossidazione reversibile della
specie originale.. Nel profilo CV sono stati osservati fenomeni di adsorbimento ''Weak-to-strong' che nella
maggior parte dei casi portano all''accumulo di particolato sulla superficie dell''elettrodo e quindi ad un
comportamento irreversibile. Nel caso dell''elettrodo ad oro comunque è stato osservato un comportamento
molto più riproducibile anche se n questo caso erano presenti fenomeni di adsorbimento responsabili per il
pattern asimmetrico del voltammogramma e l''apparente più larga corrente anodica (forward scan) rispetto
alla catodica (reverse scan). Questo aspetto è risultato particolarmente evidente per il composto 34. In tal caso
infatti, la crescita di una intensa spalla anodica situata a potenziali meno positivi rispetto al picco principale
suggerisce un adsorbimento relativamente forte del prodotto di ossidazione anodica sulla superficie di oro. 49 Visti I gruppi funzionali della molecola in questione, ciò può succedere molto facilmente. Oltre allo zolfo, sia i
gruppi fenilici che i gruppi carbossilici possono promuovere l''adsorbimento sull''oro; ciò complica molto
l''identificazione della natura esatta del processo. Si è cercato di superare I problemi relativi all''adsorbimento e
loro effetti sulla morfologia della curva di CV, valutando I potenziali standard delle molecole: 0.82, 0.86 e 0.88
V per i composti 30, 31 e 34, rispettivamente.
Sulla base di questi risultati, e assumendo di poter direttamente confrontare i potenziali determinati nelle
condizioni della voltammetria ciclica (solventi apolari, aprotici) con quelli misurati in solvente acquoso tutti I
composti in effetti non dovrebbere realmente mostrare una apprezzabile attività antiossidante con i test TEAC,
DPPH o FRAP. I potenziali redox delle coppie ABTS '+/ABTS (TEAC), DPPH'/DPPH, (TPTZ)2Fe3+/(TPTZ)2/Fe2+ (FRAP) sono infatti 0.68 V, 50 0.28 V,51 and 0.77 V,52 rispettivamente e poi ABTS'+, DPPH', (TPTZ)2Fe3+ possono essere ridotti termodinamicamente da composti con potenziale di riduzione più basso. Questo è applicabile a
tutti gli N-tiometil β-lattami qui sintetizzati ad eccezione dei composti 38, 39 e 40. Questi composti infatti
contangono gruppi fenolici sulla catena laterale e molti composti di natura fenolica hanno potenziali di
ossidazione più bassi anche reagendo ABTS '+, DPPH' e (TPTZ)2Fe3+. In conclusione, la bassa attività antiossidante del composto 1 osservata nel precedente lavoro non può essere
attribuita, sulla base dei potenziali standard riportati qui, al trasferβimento di elettroni ''outer-sphere' tra
l''atomo di zolfo (donatore) e i reagenti usati per i test di ossidazione (HOO ', ABTS'+, (TPTZ)2Fe3+, accettori) perché la forza guida sarebbe largamente sfavorevole. D''altra parte si può ipotizzare la formazione di un
complesso tra il β lattame e i reagenti usati per I test di ossidaziobe. Quindi potrebbe avere luogo una sorta di
interazione tra I due ''partners' che sarebbe in grado di rendere termodinamicamente più accessibile il 49 A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical methods: fundamentals and applications 2nd, Wiley, 2001, p. 598
50 K. Schlesier, M. Harwat, V. Böhm, R.Bitsch, Free Rad. Res. 36, 2002, 177-187 51 Milardovic, D. Ivekovid, V. Rumenjak, B. S. Grabarid Electroanalysis 17, 2005, 1847-1853
52 K.M. Schaich, Cracking the code on antioxidant testing-sorting your ORAC from your FRAP, Nutraingredients Antioxidant Conference, Brussels,
June 30, 2010, slides 21 38
trasferimento di elettroni, in maniera verosimile al meccanismo ''inner-sphere' evidenziato nella reazione tra i
reagenti di Grignard e il benzofenone. 53 In linea con questa ipotesi quindi il composto 34, mostrando il più forte adsorbimento tra tutti sulla superficie
di oro, per via della stessa energia libera di adsorbimento, la sua ossidazione (inner-sphere) diventa
significativamente più facile di quella con spceie libere in soluzione (outer-sphere).

Attività antibatterica
E'' stata infine valutata l''attività antibatterica espressa come MIC in vitro su 45 ceppi clinici si MRSA isolati da
pazienti affetti da fibrosi cistica.
I test mostrano che I composti 38-40 risultano tra I più attivi con range di MIC da 16 a 128 mg/L; in particulare
il β lattame 40 ha mostrato una MIC50 e una MIC90 uguali a 64 mg/L.
In questa ultima tabella sono infine riassunti i dati di attività antiossidante e antibatterica delle molecole
testate. Malgrado I composti 19, 22, 29, 30, e 31 mostrino attività contro ceppi di S. aureus resistente [10], la
sola presenza dell''atomo di zolfo, come già discusso in precedenza, non porta la molecola ad avere grande
potere antiossidante. L''attività duale è invece presente sui composti 38, 39, 40 per via dei gruppi fenolici, in cui
I buoni risultati in termini di attività biologica possono essere un buon punto di partenza per la progettazione
di altre molecole.

1.2.3 Studi di biodegradazione dei beta lattami 17 e 29 54 La precedente discussione sulla resistenza batterica ha mostrato come essa sia sicuramente causata l''uso
massiccio e non controllato di antibiotici, fenomeno esteso all''ambito umano, all''allevamento e
all''agricoltura. I rischi in termini di salute umana e inquinamento causati dall''uso massiccio di antibiotici e/o
dai loro metaboliti sulla superficie terrestre e nel mare sta quindi ricevendo un interesse sempre
crescente.55
Studi recenti stanno cominciano ad evidenziare come l''utilizzo di grandi quantitativi di antibiotici non
biodegradabili porta alla loro persistenza in organismi marini e terreni, dove possono continuare ad
esercitare i loro effetti anche per lunghi periodi. 56Si stanno osservando fattori di resistenza non solo in casi clinici e veterinari ma anche in ''comparti' ambientali (è il caso di terreni non più coltivati e fognature) si
osserva la preseneza di microorganismi resistenti. 57 Inoltre anche in alcune acque potabili sono state trovati a volte ceppi batterici resistenti. 58 Tutti questi aspetti dovrebbero spingere allo sviluppo ragionato di nuovi antibiotici e/o loro formulazioni,
assieme alla consapevolezza di limitare il più possibile l''utilizzo indiscriminato e la diffusione nell''ambiente
di queste molecole. 59 Purtroppo a tutt''oggi solo alcune molecole e formule sono state introdotte nelle ultime decadi.
Nei precedenti paragrafi è stata descritta la sintesi e l''attività biologica di famiglie di monobattami N-
tiometilati: in particolare il composto 29, il (2R)-1-(metiltio)-4-ossoazetidin-2-il acetatoe e il 17, (2R,3R)-3-
((1R)-1-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl acetate hanno mostrato
attività promettenti su ceppi resitenti di MRSA e MSSA. Inoltre il composto 17 è stato testato su ceppi
batterici da pazienti affetti da fibrosi cistica. Si è quindi deciso di valutare una valutazione sulla persistenza
di questi due nuovi potenziali antibiotici contro ceppi batterici resistenti su acque e terreni a diversi pH, con
l''obiettivo di inquadrarne il comportamento in termini di biodegradabilità. Il cammino di biodegradazione
di questi due monobattami è stato poi paragonato a quello della amoxicillina triidrato, un antibiotico a
largo spettro a base di penicillina usato in maniera massiccia in ambito umano e veterinario dagli anni''70. 53 a) T. Holm, J. Am. Chem. Soc.115, 1993, 916-918; b) T. Holm, Acta Chem. Scand. Ser. B 42, 1998, 685-689; (c) T. Lund, D. Ohlrich, P. Borling, Acta Chem. Scand. 53, 1999, 932-937 54 D. Giacomini,, S. Blasioli, C. Fellet, A. Garelli, M. Pori, I. Braschi, ''Persistence and degradation of new -lactam antimicrobial agents in the soil-
water system', submitted to Chemosphere, 2013
55 Witte, W.,Science, 1998, 279, 996''997
56 Bergheim, M., Helland, T., Kallenborn R., Kummerer, K., Chemosphere, 2010, 81, 1477-1485 57 Séveno, N.A., Kallifidas, D., Smalla, K., van Elsas, J.D., Collard, J.M., Karagouni, A.D., Wellington, Rev. Med. Microbiol., 2002,13, 15-27
58 Pandey, S., Musarrat, J., J. Environ. Biol., 1993, 14, 267-274
59 Braschi, I., Gatti, G., Paul, G., Gessa, C.E., Cossi, M., Marchese, Langmuir 2010,26(12): 9524-9532 39
NSMe O OAc NSMe O OAc OTBS CLogKow 0.9845 CLogKow 3.8789 29 17
Biodegradazione in acqua
La prima analisi di biodegradazione è stata effettuata tramite studi cinetici di idrolisi dei β lattami
mantenuti in soluzione tampone a pH differenti (3,5,7 e 9) a 25° C al buio seguendo l''andamento della
conversione nel tempo (Grafici sottostanti e Tabella 3).












Idrolisi di 29 e 17 in soluzione acquosa a differenti pH di diversi tamponi (20 mM citrato a pH 3 e 5; 20 mM fosfato a pH 7 e 9) a temperatura
ambiente. L''idrolisi della Amoxicillina(Amox) è risportata per confronto.

Come ci si aspettava, la degradazione idrolitica a tutti i pH segue una cinetica di ordine pseudo primo come
dimostrano i coefficienti di correlazione sempre ' 0.9263. La velocità di degradazione di 29 in acqua in
funzione del pH sembra essere nell''ordine: 9 > 7 ' 5 > 3, che appare catalizzata soprattutto in ambiente
basico e poco influenzata da quello acido. L''idrolisi di 17 è molto veloce a pH 3 e 9 (rispettivamente) mentre
risulta più lenta a pH 5 e 7 ( t1/2 di 25.7 e 33.6 giorni).
Ad eccezione della cinetica osservata a pH 3, l''idrolisi di 29 è in generale più veloce rispetto a 17. La
differenza tra le due strutture è unicamente legata alla presenza del gruppo OTBS, che porta 17 ad essere
più idrofobo almeno di 4 volte come stimato dal valore di ClogKw (CLogKow di 3.8789 e 0.9845,
rispettivamente).
In acqua per gli stessi pH segue questo ordine: 5 > 7 > 9 > 3 con I relativi t1/2 of 46.1, 19.7, 14.4, and 6.2 d. I
risultati sottolineano che sia le condizioni acidi che basiche influenzano solo debolmente l''idrolisi. Il 40
cammino di degradazione acido e basico dell''amoxicillina è noto da tempo 60 e in generale si accetta che la degradazione sia più veloce a pH basico. (e.g. t1/2 = 1.2 d pH 9 e a 30°C) 61 che acidi (t1/2 = 4.7 d at pH 3 and 30°C, Chada et al., 2003), per via della natura dell''anello β lattamico, particolarmente suscettibile
all''apertura da parte dello ione OH -. dati osservati da noi sono molto diversi a causa delle diverse condizioni adottate (buffers and temperature adopted, the use of sodium azide to preserve the solutions sterility),
anche se il tren generale si idrolisi è comunque in accordo con le idrolisi alcaline e acide riportate da altre
studi.Inoltre la GlaxoSmithKline (SDS numero 2211 19-01-2006, versione 13) ha dimostrato come la
amoxicillina triidrato sia chimicamente instabile in acqua a pH neutro, con t1/2 a pH neutro nel range dei 50-
113 giorni, in buon accordo con il nostro valore di 46.1 giorni.
Questo studio mostra comunque come l''amoxicillina sia molto più persistente di 29 a tutti i pH ad
eccezione di 3, dove la sua stabilità (t1/2 = 6.2 d) è addirittura un ordine di grandezza inferiore a 29 (t1/2 =
49.5 d). Tuttavia nelle acque e nei terreni risulta inusuale la presenza di un pH così acido ma altresì risulta
comune un pH 5 dove 29 si degdrada molto più velocemente dell''amoxicillina. Si osserva anche che
l''amoxicillina è risultta essere più stabile di 17 a tutti i pH ad eccezione del pH neutro. Tabella 3 pH kobs (d -1) t1/2 (d) R 2 29 3 0.0140 (0.024) 49.5 (0.1) 0.984 (0.008) 5 0.0506 (0.000) 13.7 (0.06) 0.9820 (0.003) 7 0.0845 (0.031) 8.8 (1.2) 0.9820 (0.012) 9 0.7982 (0.000) 0.87 (0.01) 0.9986 (0.001) 17 3 0.4567 (0.0143) 1.6 (0.5) 0.9720 (0.0267) 5 0.0270 (0.0017) 25.7 (1.5) 0.9819 (0.0239) 7 0.0207 (0.0016) 33.6 (2.5) 0.9580 (0.0321) 9 0.2950 (0.0076) 2.4 (0.1) 0.9518 (0.0323) Amoxicillin 3 0.1106 (0.0094) 6.2 (0.5) 0.9757 (0.0091) 5 0.0151 (0.0018) 46.1 (5.4) 0.9700 (0.0222) 7 0.0353 (0.0023) 19.7 (1.3) 0.9403 (0.0332) 9 0.0481 (0.0028) 14.4 (0.9) 0.9263 (0.0650) Parametri cinetici (kobs = costante di degradazione di ordine 1; t1/2 = tempo di dimezzamento) per 29 e 17 l''idrolisi in soluzioni tampone nel range 3-
9.

I prodotti di idrolisi di 29 e 17 non sono stati isolati ma ipotizzati sulla base degli spettri di massa. Inoltre
non essendo definito il loro coefficiente di estinzione molare non è possibile risalire ad un valore di
concentrazione delle soluzioni. Nonostante tutto la cinetica di degradazione è stata monitorata dalle aree
dei picchi dell''HPLC. Per quanto riguarda 29, la formazione del suo prodotto di idrolisi a pH 3 è stato molto
lento e non ha portato alla formazione di sottoprodotti in quantità ragionevole. L''idrolisi a pH 9 ha
generato invece 4 sottoprodotti chiamati 29-1, 29-2, 29-3, e 29-4, quest''ultimo presente anche se in
piccola scala anche a pH 5 e 7. La struttura proposta in base agli spettri di massa ottenuti è la seguente:
acido 3-acetossi-3-((metiltio)ammino)propanoico per 29-1, acido 3-idrossi-3-(( metiltio)ammino)propanoico
per 29-2, acido 3-acetssi-3-ammino propanoico per 29-3, e acido 3-ammino-3-idrossipropanoico per 29-4.
In accordo con il pattern di biodegradazione proposto, il primo step idrolitico di 29 consiste nell''apertura
del β lattame (29-1); seguono poi due potenziali cammini. Il primo prevede la perdita di metiltiolato (29-3)
e dell''acido acetico a dare 29-4. Il secondo prevede prima la perdita dell''acetato (29-2) e poi la perdita di
metiltiolato (29-4). Entrambi i pattern portano ad un unico substrato.
Sfortunatamente l''idrolisi di 17 non porta a quantità apprezzabili di prodotti visibili all''UV per ogni pH con
l''eccezione della formazione del prodotto 17-1, osservato a pH 3, che consiste nella perdita del gruppo TBS, 60 Hou, J.P., Poole, J., J. Pharm. Sci., 1971, 60, 4, 503-532
61 Chada, R., Kashid, N., Jain, D.V.S., J. Pharm. Pharmacol., 2003, 55, 1495-1503 41
particolarmente sensibile a pH acidi. 62 A causa dell''elevata reattività di 17 in condizioni alcaline non si può escludere la formazione di prodotti di degradazione solo in base alla incapacità di osservarli all''UV: si può
anche in questo caso ipotizzare che entri in azione l''apertura del β lattame.
Fino ad ora nessuno dei prodotti di idrolisi/degradazione derivanti da 29 o 17 è stato testato dal punto di
vista della tossicità nei terreni e/o nelle acque. N O OAc SMe OTBS 17 N O OAc SMe 29 MW = 175 HN O OAc SMe 29-2 OH MW = 193 HN O OH SMe 29-1 OH MW = 151 H2O CH3COO NH2 O OAc OH 29-3 MW = 147 CH3S NH2 O OH OH 29-4 MW = 105 CH3COO MW = 333 H2O N O OAc SMe OH 17-1 MW = 219 pH = 9 CH3S pH = 3 Biodegradazione in terreno
In seguito alle analisi idrolitiche di 29 e 17, sono seguiti degli studi di comportamento in terreno. Tabella 4








Riassunto delle proprietà fisico-chimiche dei suoli analizzati
aTOC: total organic carbon bDW: Dry weight

In tabella 4 sono riassunte le caratteristiche chimiche e fisiche dei terreni slezionati per questo studio. S1 è
un terreno calcareo sabbioso e argilloso caratterizzato come ci si aspetta da pH alcalino per via del
contenuto di 54.6 g kg -1 di carbonato. S2 è un terreno argilloso, caratterizzato da un pH acido, tipico dei terreni boscosi. Il contenuto di CaCO3 in S2 non è stato misurato poichè a pH più basso di 7, si considera di
quantità minima. Il quantitativo totale di carbonio organico (TOC) è molto alto (21.8 g kg -1) per S2, ma molto più basso (7.66 g kg -1) in S1. Anche se non sono normalmente presenti antibiotici nei terreni boscosi, S2 è comunque stato scelto per le sue importanti caratteristiche di avere un basso pH e un alto contenuto
di carbonio organico. 62 Wuts, P.G.M., Greene, T.W. Greene''s Protective Groups in Organic Synthesis, IV edition 2007 Wiley-Interscience Hoboken, New Jersey pages 196-
206. Soil pH CaCO3 (g kg - 1) Texture (%) TOC a (g kg -1) Water content (% soil DW b) H2O CaCl2 Sand Silt Clay Wilting point Field capacity S1 8.16 7.87 54.6 (5.9) 37 32 31 7.66 (0.69) 2.3 (0.2) 28.0 (2.0) S2 5.02 4.18 n.d. 40 44 16 21.8 (1.06) 1.5 (0.2) 36.6 (3.4) 42
Il comportamento di 29 e 17 è stato studiato nei due terreni in due differenti status di acqua (tabella 5):
''wilting point' (minima quantità di umidità che una pianta richiede per non appassire) e ''field capacity'
(costante idrogeologica di ciascun terreno che ne definisce il contenuto di umidità). Il wilting point è
descrittivo dei terreni ai più alti valori di potenziale redox causate da una ossigenazione massimale e aridità
severa per le piante (contenuto di acqua del 2.3% e del 1.5% DW per S1 e S2, rispettivamente). Invece la ''
field capacity '' è tipica per le grandi quantità di acqua che possono ritenere I terreni e quindi disponibili per
le (contenuto di acqua del 28.0% e del 36.6% DW per S1 eS2 rispettivamente).
La degradazione degli antibiotici in entrambe le situazioni di contenuto di acqua è stata seguita nei terreni
dopo la riduzione della attività microbiologica per discriminare il contributo dei fattori abiotici all''intero
processo di degradazione; è quindi riportata la persistenza degli antibiotici nei terreni S1 e S2, entrambi
non trattati o autoclavati, al wilting point e al field capacity è riportato. Le cinetiche di degradazione nei
terreni sono state interpretate, se possibile, usando una legge del primo ordine. (see kobs and t1/2, Table 2).
Per quelle cinetiche che non hanno seguito il primo ordine, la determinazione del t1/2 è stata fatta con
interpolazione visuale dei dati sperimentali.
Wilting point
Le cinetiche di degradazione di 29 nei terreni non trattati S1 e S2 mantenuti al wilting point hanno seguito
una cinetica del primo ordine con un t1/2 di 35.0 e 70.7 d, rispettivamente, come mostrato dai coefficienti di
correlazione accettabili (R 2 ' 0.8616). Nei terreni autoclavati, la persistenza di 29 era più alta di quelli non trattati, aspetto imputato alla forte riduzione del contributo microbico che può causare la completa
degradazione, con t1/2 leggermente più alti per S1 che per S2 (151.0 e 125.0 d, rispettivamente).
Diversamente dalla veloce degradazione di 29 in condizioni alcaline, (t1/2 0.87 d at pH 9, Table 1), il terreno
calcareo autoclavato S1 a pH 8.16 è stato in grado di degradare 29 meno rapidamente di quello che è stato
osservato nei terreni boscosi acidi autoclavati S2 a pH 5.02. Molto probabilmente, il terreno acido contiene
componenti specifici in grado di catalizzare la degradazione di 29. A questo riguardo, è interessante notare
che il terreno S2 è caratterizzato da un maggior contenuto di argilla e carbonio organico totale (TOC),
almeno doppio se paragonato a S1: forse questi conponenti sono hanno favorito di più la degradazione di
29 rispetto alla catalisi alcalina effettuata dal terreno S1.
La degradazione di 17 nei terreni non trattati al wilting point non ha seguito la cinetica di primo ordine e il
suo t1/2 è stato dedotto dalla sua curva di degradazione. La degradazione è stata molto veloce (t1/2 = 1.7 e
2.5 d per S1 e S2, rispettivamente), con una persistenza leggermente più bassa in S1 che in S2, come già
osservato per 29. Come previsto, la degradazione di 17 in terreni autoclavati è stata molto più lenta e ha
seguito una cinetica del primo ordine (R 2 ' 0.9236) con un t1/2 di 32.2 d nel terreno S1 e 21.7 d in S2; si conferma quindi la più alta attività di degradazione dei β lattami scelti nel terreno acido S1 rispetto al
terreno basico S2. In generale, in entrambi i terreni al wilting point, 17 è risultato più degradabile di 29.
Per quanto riguarda la degradazione della amoxicillina, non è stata osservata alcuna diminuzione della sua
concentrazione nelle tre settimane di monitoraggio: questo dimostra come l''amoxicillina sia la molecola β
lattamica più persistente tra quelle testate al wilting point.

Field Capacity
La persistenza di 29 alla field capacity è risultata molto bassa in entrambi I terreni non trattati (t1/2 = 0.80 e
1.51 d per S1 e S2, rispettivamente) e autoclavati S1 mentre, nell''autoclavato S2, 29 è stato più persistente
(t1/2 of 38.99 d). Ciò dimostra un importante contributo al processo degradativo solo per il terreno acido S2,
dovuto alla componente microbiologica a questa water capacity. Al contratio, la bassa persistenza di 29 nei
terreni autoclavati calcarei S1 può essere associata alla catalisi basica dello stesso terreno. In paragone al
wilting point, I terreni alla field capacity sono risultati più attivi nel degradare 29 indicando che il contenuto
acquoso del terreno sembra influenzare notevolmente la degradazione di questo beta lattame; il
contributo biotico alla degradazione complessiva appare invece meno importante ad eccezione del terreno
acido.
La degradazione di 17 alla field capacity è stata molto veloce in entrambi I suoli calcarei S1 (trattati e
autoclavati, con t1/2 = 0.13 e 0.79 d, rispettivamente) e suoli boscosi S2 (trattati e autoclavati con t1/2 =
1.77 e 3.44 d, rispettivamente). Paragonando questi risultati con quelli ottenuti al wilting point, è chiaro
che il contributo abiotico alla degradazione complessiva sia più rilevante a terreni con contenuto di acqua 43
maggiore. Alla field capacity, il contributo biotico e abiotico alla degradazione complessiva è risultato
simile.
La persistenza della amoxicillina nei terreni non trattati e autoclavati alla field capacity è risultata molto
bassa con t1/2 nel range 0.43-1.74 d. Sfortunatamente, in letteratura non sono presenti dati relativi alla
persistenza e/o degradazione della amoxicillina nei terreni.
I due prodotto di degradazione di 29 nel suolo calcareo S1 al wilting point sono stati osservati e identificati
come 29-A e 29-C in base ai tempi di ritenzione all''HPLC, UV e massa (gli stessi prodotti sono stati già
trovato in nei suoli alcalini, schema 2). La formazione di questi prodotti può essere sicuramente associata al
pH alcalino del suolo S1, essendo loro presenti nei suoli autoclavati. Alla ''field capacity' si è osservata
subita la formazione di 29-B e 29-C nel primo giorno, mentre al secondo giorno si è osservata la presenza di
29-C all''UV. Sono inoltre stati trovati due sottoprodotti di degradazione chiamati 29-E (max 243 nm) e 29-6
(max 287 nm) non identificabili nemmeno tramite il loro pattern di massa nei terreni non trattati S1 al
punto di wilting; si ipotizza una degradazione di natura biologica. Al ''field capacity' non è stato trovato
alcun prodotto corrispondente a 29; anche in questo caso si ipotizzano degradazioni di origine
microbiologica.
Nel suolo acido S2, non sono stati trovati prodotti di degradazione UV-visibili legati a 29 nè al punto di
wilting nè al field capacity. Nonostante tutto, osservando il trend di degradazione del prodotto 29, è chiaro
come sia molto importante il meccanismo biotico di degradazione, mentre le componenti abiotiche sono di
una certa importanza solo al ''field capacity'. Solo nei suoli autoclavati al wilting point, sono stati trovati
due sottoprodotti: 29-7 (max 277 nm) e 29-8 (max 283 nm), la cui struttura non è stata identificata. La loro
assenza nei suoli non trattati può essere indicativa di: i) alta degradabilità in presenza di microorganismi
e/o 2) cammini di degradazione alternativi di natura abiotica.
Per quanto riguarda la degradazione di 17 nei suoli calcarei, nonostante la sua scarsa persistenza, (t1/2 0.13-
1.77 d), non sono stati trovati sottoprodotti visibili all''UV, molto probabilmente per via delle trasformazioni
abiotiche e biotiche molto veloci. Nel suolo boscoso acido, 17-1 è stato trovato da subito assieme a due
nuovi sottoprodotti: 17-5 (max 275 nm) e 17-6 (max 215 nm). Tutti e 3 I prodotti sono stati trovati anche nei
suoli autoclavati e quindi la loro formazione può essere tranquillamente associata a processi del terreno dal
punto di vista abiotico. As the presence of all three byproducts was observed also in the autoclaved soil,
their formation can be safely ascribed to abiotic processes active in this soil.
Tabella 5





























Patway di degradazione nei suoli





















calcareous soil
S1 (pH 8.16) acidic soil
S2 (pH 5.02) calcareous soil
S1 (pH 8.16) acidic soil
S2 (pH 5.02) P1-1 + P1-2 + P1-3 + P1-5 + P1-6 (abiotic tranformations) (biotic transformations) P1 P1-7 + P1-8 + no UV visible byproducts (abiotic tranformations) (biotic transformations) no UV visible byproducts/rapid degradation (biotic transformations) P2 P2-1 + P2-5 + P2-6 (abiotic and biotic transformations) calcareous soil
S1 (pH 8.16) acidic soil
S2 (pH 5.02) calcareous soil
S1 (pH 8.16) acidic soil
S2 (pH 5.02) P1-1 + P1-2 + P1-3 + P1-5 + P1-6 (abiotic tranformations) (biotic transformations) P1 P1-7 + P1-8 + no UV visible byproducts (abiotic tranformations) (biotic transformations) no UV visible byproducts/rapid degradation (biotic transformations) P2 P2-1 + P2-5 + P2-6 (abiotic and biotic transformations) 1.3 L''anello β lattamico nelle molecole biologicamente attive: Inibitore enzimatico
e altre attività
L''anello β lattamico soprattutto di specie monocicliche, come si è cominciato ad osservare negli ultimi 20
anni, se opportunamente derivatizzato si è dimostrato essere un farmacoforo in grado di dirigere l''attività
biologica verso target diversi e assumere proprietà e funzionalità completamente nuove. In particolare sono stati sintetizzati diversi β lattami in grado di fungere da inibitori enzimatici per serino-
proteasi (l''elastasi leucocitica umana (HLE), l''antigene specifico della prostata, trombina, -chimotripsina e
-amminoacidi transferasi) cui si sommano, altre strutture da utilizzare per la terapia della tubercolosi, del
cancro e anche come antiinfiammatori.
Sono uscite diverse review che riassumono le innumerevoli attività biologiche di queste molecole ed è spesso difficile elencarle in maniera razionale. Una recente review 63 riassume l''attività biologica di questi substrati con una chiave di lettura
associata alla struttura chimica; elencherò brevemente le strutture β
lattamiche più significative. Tra le strutture più famose ci sono di sicuro i
derivati alogenati, tra cui i 3 e i 4 cloro monobattami. I 3-cloro vengono
facilmente ottenuti tramite reazione di Staudinger 64 e costruiscono una numerosa famiglia di derivati antibatterici, antifungali e antifilarici. Molto
attivi come antibatterici sono risultati gli N-idrazino derivati, 65 in cui risulta importante per l''attività la presenza di un gruppo elettron attrattore. I 4 cloro monobattami 66 vengono normalmente ottenuti tramite degradazione della penicilline,

con l''apertura dell''anello biciclico e sostituzione dello zolfo con cloro grazie ad agenti clorinanti. Un''altra
classe derivante da penicilline e/o cefalosporine è quella dei 3 ammino derivati. 67 Questi derivati sono risultati quasi tutti essere degli antiproteasici. Le prime due molecole qui rappresentate inibiscono la
Catepsina K, una cisteino-proteiasi, trovata essere sovraespressa soprattutto negli osteoclasti. L''ultima
molecola risulta invece essere inibitrice di un''altra cisteino-proteasi, la papaina. I 3 e i 4 alchiliden β lattami,
rappresentano strutture in cui sul C3 o sul C4 è presente un doppio legame. La classe dei 4 alchilideni è stata 63 P. Galletti* and D. Giacomini, Current Medicinal Chemistry, 2011, 18, 4265-4283
64 Staudinger, H. Zur Kenntniss der Ketene. Diphenylketen. Justus Liebigs Ann. Chem., 1907, 356, 51''123
65 Mishra, S. K.; Mishra, P.; Gupta, C.P.; Kannojia, P.; Garud, N.; Tomar, V., J. Pharm. Res., 2010, 3(4), 900-905
66 Ceri�, H.; �indler-Kulyk, M.; Kova�evi�, M.; Peri, M.; ivkovi, A., Bioorg. Med. Chem. 2010, 18,3053''3058
67 a) Setti, E.L.; Davis, D.; Chung, T.; Mc Carter, J. 3 Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 2051''2053; b) Setti, E.L.; Davis, D.; Janc, J.W.; Jeffery, D.A.;
Cheung, H.; Yu, W. 3,4- Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005, 15, 1529''1534; c) Zhou, N.E.; Guo, D.; Thomas, G.; Reddy, A.V.N.; Kaleta, J.; Purisima, E.;
Menard, R.; Micetich, R.G.; Singh, R.,Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 139''141. studiata molto dal mio gruppo di ricerca, osservando una moltitudine di attività biologiche. Questa classe di
molecole viene facilmente sintetizzata tramite un protocollo messo a punto dal gruppo di ricerca in cui ho
svolto la mia tesi di dottorato, come ho giò affermato in precedenza.


Oltre all''attività antibiotica e l''attività antiossidante che abbiamo già descritto in precedenza queste
molecole sono risultate attive come inibitori enzimatici. Sono risultatii inibitori di metallo proteasi di matrice,
proteine che risultano coinvolte in numerosi processi di rimodellamento tissutale associati alla crescita ed
allo sviluppo e in varie patologie; in particolare provocano l''inibizione dei fattori di crescita autologhi,
provocando un rallentamento oppure un blocco della riparazione dei tessuti lesionati. Ma i 4 alchilideni, se
N-acilati, sono risultati attivi sulla Elastasi Leucocitaria Umana (HLE), un insieme di serino proteasi espresse
da leucociti polimorfici, in particolare neutrofili, che a livello intracellulare agiscono uccidendo i patogeni e a
livello extracellulare si comportano invece da mediatori della coagulazione e riparazione delle ferite.
Un''altra classe molto importante è sicuramente quella degli N-Aril, C4-Aril monobattami. 68 Tra i più famosi vi sono questi derivati, risultati particolarmente attivi nell''inibire la crescita di cellule di cancro al seno a
concentrazione nanomolare. La prima molecola è in grado di bloccare queste cellule nella fase G2/M e
inibire la polimerizzazione della tubulina con grande efficacia, simile a quella della Combretastatina


68 Carr, M.; Greene, L.M.; Knox, A.J.S.; Lloyd, D.G.; Zisterer, D.M.; Meegan, M.J., Eur. J. Med. Chem., 2010, 45, 5752-5766 NH O CO2Et O O HO HO OH NH O CO2Et O O HO OH N O CO2Et OTBS OBn OBn OBn O Human Leucocite Elastase IC 50 0.5 μM MetalloMatrix Protease-2 Protease-9 IC 50 70 µM IC 50 50 µM Antioxidant Activity Rac: 0.23 μM TEAC: 1.76 nM 15% ROS inhibition at 10μM on mioblast H9c2 cells N O OTBS SMe COOEt MRSA A931 MIC: 8
MSSA A625 MIC: 4 β lattami come inibitori di HDAC 69 L''unicità farmacoforica dell''anello β lattamico lo ha portato anche ad essere studiato come inibitore
enzimatico di Histone Deacetylases (HDACs). 70 Gli enzimi HDACs (istoni deacetilasi), insieme con i rispettivi antagonisti HATs (istone acetiltransferasi), ricoprono un ruolo fondamentale nell''equilibrio dello stato
acetilato/deacetilato degli istoni, unità proteiche presenti nella cromatina delle cellule eucariote. Gli istoni
sono responsabili della regolazione di importanti fenomeni come l''espressione dei geni e l''assemblaggio
della cromatina; lo stato acetilato di tali residui provoca un rilassamento della cromatina, aumentando
l''accessibilità dei fattori di trascrizione verso i loro geni target, 71 mentre, la deacetilazione determina un impaccamento della cromatina ed una conseguente repressione trascrizionale. 72 Sono stati scoperti 18 diversi istoni-deacetilasi nell''uomo, raggruppabili in quattro famiglie. In particolare, 11 HDAC operano
attraverso un meccanismo zinco-dipendente: la I classe (HDAC1, -2, -3 and -8), la II classe (HDAC4, -5, -6, -7,
9, -10) e la IV classe (HDAC11); la III classe, invece, adopera NAD + come cofattore. La I e la IV classe di HDACs sono espressi ubiquitariamente in particolar modo nel nucleo e sono correlati a processi di trascrizione o co-
repressione della proliferazione e sopravvivenza delle cellule. 73 Ad oggi sono state riconosciute agli inibitori HDAC importanti proprietà come agenti capaci di modificare la
trascrizione genetica, di inibire la proliferazione e di indurre direttamente l''apoptosi di cellule tumorali, sono
anti-angiogenici, molti inibitori HDAC, infatti, sono in grado di diminuire o bloccare la formazione di geni
angiogenici, anti-invasivi ed immunomodulatori sia in vitro che in vivo. 74 Da diverse ricerche è emerso che gli inibitori di HDAC sembrano influire su diversi tipi di tumori sia solidi che ematici, fra cui il neuroblastoma,
melanoma, leucemie, cancro della mammella, della prostata, dei polmoni, delle ovaie e del colon. Inoltre,
sono in grado di interferire con la differenziazione di cellule endoteliali progenitrici. 75 La determinazione delle interazioni tra gli inibitori ed il sito attivo dell''enzima ha permesso di identificare il
modello farmacoforico di un inibitore HDAC prendendo come riferimento la TSA (inibitore di HDACs 1, 3, 4, 6
e 10 con vaori di Ic50 attorno ai 20 nM). Gli inibitori HDAC sono tipicamente costituiti da un ''capping group'
che interagisce con i residui ammino acidici presenti all''entrata del sito attivo, da uno ''zinc-binding-group'
(ZBG) fondamentale per la coordinazione dell''atomo di zinco presente nel sito attivo e un ''linker', uno
spaziatore di opportuna lunghezza capace di posizionare lo ZBG in un canale idrofobico ed il cap nella giusta
posizione. N H OH Tricostatina A (TSA) Me2N O O Cap group Linker Metal-binding-group Il mio gruppo di ricerca si è occupato recentemente della sintesi di derivati monobattamici mimanti la
struttura del SAHA (o Vorinostat) dei quali si è valutata l''attività come specifici inibitori di HDAC8 e HDAC6.
L''obiettivo era quello di sfruttare l''anello β lattamico come ZBG, viste le proprietà complessanti dell''anello e
in particolare si è osservato che la selettività verso una isoforma o l''atra era particolarmente dipendente
dalla natura del sostituente sull''azoto β lattamico. 69 C. Ventrici, Progettazione e sintesi di nuovi intermedi azetidinonici,TESI DI DOTTORATO, 2009.
70 S. Oha and J.-C. Jung, Z. Naturforsch., B: J. Chem. Sci., 2007, 62b, 1459''1464 71 Shahbazian, M. D. and Grunstein, M. Annu. Rev. Biochem. 2007, 76, 75-100
72 a) Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J. And Allis, C. D. Natyre Rev. Mol. Cell Biol. 2008, 8, 983-994;b) V.G. Allfrey, R. Faulkner, A.E. Mirsky Proc.
Natl. Acad. Sci.USA, 1964, 51, 786-794. 73 I. Gregoretti, Y.-M. Lee and H. V. Goodson, J. Mol. Biol., 2004, 338, 17
74 a) J. Arts, P. Angibaud, A. Marien, W. Floren, B. Janssens, P. King, J. Van Dun, L. Janssen, T. Geerts, R. W. Tuman, D. L. Johnson, L. Andries, M. Jung,
M. Janico and K. Van Emelen. Br. J. Cancer, 2007, 97, 1344; b) Haggarty, S. J., Koeller, K. M., Wong, J. C., Grozinger, C. M., and Schreiber, S. L. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 4389-4394 75 Qian, D. Z. et al. Clin. Cancer. Res. 2006, 12, 634-642.
I risultati ottenuti sull''interazione selettiva con queste HDAC ci ha portato a progettare strutture
monobattamiche in grado di avere effetto sul processo di differenziamento cellulare, aspetto strettamente
connesso alla stessa attività delle HDAC.
Il differenziamento indica la maturazione di una cellula o di un tessuto da una forma primitiva o
indifferenziata a una forma matura o differenziata, con funzioni specializzate; è un processo che le cellule di
un organismo pluricellulare complesso subiscono per ripartirsi i compiti. Le molecole note per avere un
effetto diretto e importante sul differenziamento cellulare sono i retinoidi, molecole che regolano processi
chiave correlati alla vita modulando l''espressione dei geni a livello della proliferazione, migrazione,
differenziazione e apoptosi cellulare mediante meccanismi ancora oggi in gran parte sconosciuti. 76 Ma questi derivati sono anche cofattori fondamentali del meccanismo della visione, oltre che coinvolti nella
H N H N OH O O Vorinostat (SAHA)
regolazione e riparazione delle cellule epiteliali del derma.
Dal punto di vista strutturale i retinoidi sono tutte quelle molecole riconducibili alla vitamina A (acido
retinoico, retinale e retinolo) e al suo scheletro. Sono tutte molecole altamente lipofile e idrofobe dalla
struttura polienica coniugata caratterizzate da un''estremità ciclica apolare e un''altra polare. In ambito
chimico e farmaceutico sono note 3 generazioni di retinoidi.
COOH Acido Retinoico CHO O H Retinale Retinolo
La prima e la seconda generazione sono molecole molto abili a legare i recettori nucleari retinoici, mentre la
terza generazione risulta essere più specifica verso alcune classi di recettori. La seconda e la terza
generazione è rappresentata da retinoidi di sintesi sviluppati soprattutto in relazione a problemi della pelle,
da semplici irritazioni al cancro, all''invecchiamento.
Il retinoide più importante è sicuramente l''acido retinoico. Gli effetti dell''acido retinoico sono mediati
dall''eterodimerizzazione dei RAR (Retinoic Acid Receptor) nucleari, una famiglia di fattori di trascrizione
ligando-dipendenti, e dai RXR (Retinoid X Receptors). 77 Inoltre, i retinoidi in generale sono noti per attivare/inibire la cascata MAPK (Mitogen-activated protein
kinases), meccanismo coinvolto nell''arresto della cresicta e della proliferazione cellular. Inoltre alcuni
derivati retinoici sintetici sono anche in gradi di esercitarte effetti di differenziazione piuttosto che fenomeni 76 a) Farooqui A.A., Antony P., Hong W.Y., Horrocks L.A., Freysz L. Brain Res Brain Res Rev, 2004, 45, 179-195; b) Tsai F.M., Shyu R.Y., Lin S.C., Wu
C.C., Jiang S.Y., BMC Cell Biol, 2009,10-15; c) Ueki S., Mahemuti G., Oyamada H., Kato H., Kihara J., Tanabe M., Ito W., Chiba T., Takeda M.,
Kayaba H., Chihara J.J Immunol 2008,181,7689-7698.
77 Mangelsdorf D.J., Evans R.M., Cell, 1995 83, 841-850 N O SMe HDAC8 >1000 μM HDAC6 30.9 μM HDAC8 >64 μM HDAC6 > 1000 μM N H O O N H P h di apoptosi, bloccando lo sviluppo di tumori in linee cellulari cancerose. 78 Proprio per questo alcuni retinoici sono usati anche già adesso come potenziali chemioterapici nel trattamento di numerosi classi di cancro
(neuroblastoma, cancro al seno, ai polmoni, rabdomiosarcoma e molti altri). 79
2.3.1 Sintesi e attività di un nuovo ibrido β lattame-retinoide
Vista l''importanza dei derivati retinoici nei meccanismi che regolano i processi fondamentali della cellula e la
capacità dell''anello β lattamico di interagire con le HDAC, proteine strettamente connesse a questo
fenomeno, è stata progettata e messa a punto una sintesi di un ibrido retinoide/β-lattame valutando
successivamente la gli effetti di differenziazione su linee cellulari tumorali di neuroblastoma SH-SY5Y. E'' in
primo luogo importante ricordare che il solo acido retinoico, su queste cellule neurali, porta alla formazione
di collegamenti di natura pseudoassonica tra le varie cellule. 80 NH O H N O
Lo scheletro di questa molecola è quello dei 4 alchilideni che come si è visto in precedenza hanno mostrato
interessanti attività biologica sia come antibiotic che come inibitori enzimatici. La strategia utilizzata per la
sintesi, come si osserva nel seguente schema retrosintetico, consiste in un coupling ammidico tra il l''acido
carbossilico del 4 alchilidene β lattame e l''ammina retinoica.
NH O COOH + H2N NH O H N O NH O OAc O amidation

Sintesi del β lattame
I 4 alchilideni 2 azetidinoni vengono sintetizzati tramite protocollo noto e sviluppato nel nostro laboratorio a
partire dai 4-acetossi azetidinoni commerciali e diazoesteri in presenza di un acido di Lewis. 78 a) Meister B., Fink F.M., Hittmair A., Marth C., Widschwendter M., Anticancer Res, 1998, 18, 1777-1786; b) Maurer B. J., Metelitsa L.S., Seeger R.C.,
Cabott M.C., Reynolds C.P., J Natl Cancer Inst, 1999, 91, 1138-1146
79 a) Sabichi A.L., Modiano M.R., Lee J.J., Peng Y.M., Xu M.J., Villar H., Clin Cancer Res 2003 9 2400-2405; b) Garaventa A., Luksch R., Lo Piccolo M.S.,
Cavadini E., Montaldo P.G., Pizzitola M.R., Clin Cancer Res 2003, 9, 2032-2039; c) Lotan R., J Natl Cancer Inst, 1995, 87, 1655''1657; d) Hansen L.A.,
Sigman C.C., Andreola F., Ross S.A., Kelloff G.J., De Luca L.M., Carcinogenesis. 2000, 7, 1271''1279
80 T. Sakuma, K. Uzawa, T. Onda, M. Shiiba, H. Yokoe, T. Shibahara, H. Tanzawa, Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell
carcinoma, Int. J. Oncol. 29 (2006) 117''124 NH OAc O NH O COOBn NH O COOH TMSCl, Et3N, TiCl4 CH2Cl2, 0° rt NH O + COOBn Pd/C (10%) THF, -78°C N2 OBn O + 9 7 48
Il 4-alchilidene viene ottenuto con una resa del 43% in un rapporto diastereomerico E/Z di 41/59 utilizzando
benzildiazoacetato e TiCl4 come acido di Lewis. Per la sintesi siamo interessati al solo β lattame in
conformazione Z, il quale si separa facilmente tramite flash cromatografia. Si procede poi all''idrogenolisi con
Palladio su Carbone in una miscela 1:1 THF-metanolo ottenendo il β lattame 4 alchilidene acido carbossilico
(48). E'' interessante notare come questa procedura di idrogenolisi non porti alla riduzione del doppio
legame.

Sintesi del retinoide
L''ammina retinoica viene ottenuta facilmente in 3 step partendo dal β ionone, un substrato chetonico
commercialmente disponibile. Il primo step corrisponde alla addizione di Litioacetonitrile in THF a -78° e alla
sintesi dell''alcol terziario 49. Si effettua poi la disidratazione dell''alcol in toluene utilizzando acido p-toluen
solfonico in quantità catalitica, ottenendo una miscela cis/trans del nitrile insaturo.
O LiCH2CN THF, -78°C OH TsOH (10%) Toluene, '' CN CN THF, -78°C 0°C LiAlH4 NH2 51E/51Z 50E/50Z 49 NH O COOH 48 NH O O H N NH O O H N EDCI, DMAP DCM, 0°C rt 52E 52Z La reazione di disidratazione è risultato essere il passaggio più delicato, strettamente legato alla quantità di
acido paratoluensolfonico utilizzato. Quantità maggiori di acido possono portare alla formazione di isomeri
e/o a decomposizione dell''acido di partenza. La miscela E/Z del nitrile 50 viene poi ridotta all''ammina 51
con LiAlH4; l''ammina retinoica in miscela E/Z così ottenuta viene utilizzata nel successivo processo di
coupling senza la separazione dei due diastereoisomeri.
Il processo di coupling tra il β lattame 48 e l''ammina 51 viene svolto facilmente in DCM utilizzando EDCI
come attivatore e DMAP in quantità stechiometrica come base. La miscela E/Z dei due β lattami 52 viene
poi facilmente separata tramite flash cromatografia e le configurazioni assegnati tramite analisi NOE1D. Test di proliferazione
I test biologici sono stati effettuati sulla molecola 52E e sul seguente N-tiometil β lattame MP171 (già
precedentemente sintetizzata dal mio gruppo di ricerca e testata), inibitore selettivo in vitro di HDAC8,
istone deacetilasi strettamente correlata al neuroblastoma. In particolare l''espressione dell''HDAC8 (class I
member) è stata correlate scarsamente con il neuroblastoma, 81 ma in linee cellulari di neuroblastoma gli inibitori selettivi di HDAC8 inducono la differenziazione e l''arresto della proliferazione. 82 Gli effetti del β-Lattame MP171 sulla crescita della linea SH-SY5Y. La velocità di cresicta cellulare è stata verificata come numero di cellule totali. Le
cellule sono state incubate in presenza di MP171 a concentrazione 7.5 uM e contate alle ore 24,48,72,96.

Le cellule SH-SY5Y sono state esposte per 24, 48, 72 e 96 ore all''N-tiometil β lattame (ad una concentrazione
inferiore a quella che risulta citotossica) e contate quitodianamente, in modo da costruire un grafico in cui il
numero delle cellule viene messo in relazione al tempo di esposizione. Dopo 24 ore di contatto delle cellule,
si osserva una riduzione nella proliferazione cellulare per ogni tempo osservato, rispetto al controllo. Anche
se la riduzione è stabile, non si hanno grandi effetti sulla proliferazione raddoppiando il tempo di
esposizionedopo 24 ore. (TdCTRL=39. hrs; TdM2971= 38.7 hrs).
Essendo queste cellule derivanti dal neuroblastoma, la linea SH-SY5Y tende spesso a differenziare tramite
una reticolazione di natura neurale. L''acido retinoico (RA) è un potente differenziante causando l''inibizione
della crescita della cellula, l''allungamento del neurita e la ramificazione. Il trattamento delle cellule con acido
retinoico per 6 giorni induce infatti una differenziazione di natura neurale, come mostrato con tubulina-Bill e
neurites outgrowth. Paragonando questo effetto a quello ottenuto con il β-lattame 52E non si osserva la
stesso allungamento dei neuriti e lo stesso livello di ramificazione. La marcatura con NF-200 non mostra
alcun visibile effetto di differenziamento, mentre la tubulina-Bill mostra in effetti un cambiamento nella
morfologia che può indicare un possibile effetto di differenziazione.
81 S. Balasubramanian, J. Ramos, W. Luo, M. Sirisawad, E. Verner, J.J. Buggy, , Leukemia (2008)
82 Oehme I., Deubzer E., Wegener D., Pickert D., Linke J.P., Hero B., Kopp-Schneider A., Westermann F., Ulrich S.M., von Deimling A., Fischer M., Witt
O. Clin. Cancer Res. (2009) Gli effetti del β lattame 52E sul ''network' citoscheletrico delle cellule SH-SY5Y. Le cellule sono state trattate per 6 giorni con 52E 10 uMolare e RA 10
uMolare e fissate per verificarne l''immunofluorescenza. La BIII-tubulin (A-C) e I neurofilamenti (D-F) sono stati utilizzati per investigare un possibile
microtubulo e filamenti di riarrangiamento intermedio. Il trattamento con l''azetininone 52E (B, E) induces a small induce un piccolo effetto
differenziativo, ma ancora minimale se paragonato all''acido retinoico.























1.4 L''anello β lattamico come sintone: sintesi di β amminoacidi 69 I β lattami, come abbiamo visto, sono molecole importanti in ambito biologico. Essi però possono essere
considerati non solo il punto di arrivo ma anche il punto di partenza per la sintesi di molecole più complesse
contenenti azoto. Questo concetto è stato ribadito da Ojima, che ha definito il β lattame come sintone, 83 cioè come precursore di altre molecole dotate di un certo interesse.
La natura del β-lattame lo porta ad essere il precursore ideale dei β-amminoacidi: l''anello 2 azetidinonico
può essere infatti visto come un β amminoacido in cui il gruppo carbossilico e amminico sono
simultaneamente protetti.
I β-amminoacidi sono molecole naturali molto meno abbondanti dei più comuni α-amminoacidi e sono
presenti in strutture peptidiche ma anche in composti naturali tra cui ad esempio l''acido pantotenico
(vitamina B5), il quale contiene una β alanina condensata all''acido pantoico. In termini di struttura possono essere classificati come β 2-amminoacidi, β3-amminoacidi e β2,3-amminoacidi in funzione della sostituzione in posizione α e β.
Il fatto che β amminoacidi siano molecole dotate di grande interesse è da ricercarsi nella loro attività
biologica di inibitori enzimatici ed agenti antibatterici 84, ma, soprattutto, nel loro impiego come building blokcs per la sintesi di numerosi derivati naturali e non biologicamente attivi. Alcuni esempi sono la
Lipogrammistina A 85, tossina ittica sintetizzabile a partire dalla β alanina.
Un Schmigbaur 86, riporta una sintesi cui l''acido -glutammico viene utilizzato come chelante di Mg2+ ai fini di determinare il meccanismo di azione, a livello molecolare, dei sali di Mg 2+, cofattori di diversi enzimi implicati nella biochimica degli acidi nucleici.
Vista l''importanza sintetica dei β amminoacidi, sono numerose le strategie chimiche e biocatalitiche
esplorate per il loro ottenimento, con l''obiettivo di ottenerli in forma enantiomericamente pure. In
letteratura sono state esplorate molte metodologie in cui il β lattame è il building block per la sintesi.
Sono però note molte strategie di natura biocatalitica che spesso si avvalgono del fenomeno della
risoluzione cinetica per opera di idrolasi e/o esterasi. 83 Ojima, I. Adv. Asym. Synth. 1995, 1, 95
84 Fulop, F., Chem. Rev. 2001, 101, 2181-2204.
85 Fujiwara, Akiko; Kan, Toshiyuki; Fukuyama, Tohru. Synlett 2000, 11, 1667-1669. 86 F. Wiesbrock, S. Nogai, A. Schier, and H. Schmidbaur, Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 1151-1157. Forrò risporta una reazione di idrolisi stereoselettiva catalizzata dall'enzima CAL-B, una esterasi e la sua
selettività.
I recenti studi di Forrò hanno dimostrato che due fattori sono importanti per il controllo
dell'enantioselettività: ' la temperatura: la reazione deve essere condotta ad elevate temperature (tra i 60°C ed i 70°C)
' l'attività dell'acqua: quando si lavora in solventi organici assoluti l'acqua presente, od addizionata, funge da nucleofilo e quindi influenza la reattività del sistema ed in questo caso un elevato
contenuto di acqua riduce sia l'enantioselettività sia la conversione, per questo spesso se ne utilizza
1 equivalente. Un altro classi di enzimi utilizzati sono le β-lattamasi. Malgrado il loro impatto negativo sulle terapie con
antibiotici β-lattamici, esse sono state usate con successo in risoluzione cinetiche di β-lattamici aliciclici
utilizzando in questo caso microorganismi della specie Rhodococcus. 87 . Dong-Hui Leng 88 hanno ottenuto un''ottima risoluzione cinetica 1-arilmetil-e 1-allil-4-ossazetidin-2- carbonitrili e carbossiammidi utilizzando una nitrile idratasi da Rhodococcus erythropolis AJ270.
I β amminoacidi possono poi essere ottenuti tramite apertura chimica dei β lattami corrispondenti.
Un altro importante esempio è quello riportato da Brieva 89 i quali tramite l''utilizzo della lipasi PS30 hanno ottenuto taxani enantiomericamente puri.
87 (a) C. Evans, R. McGauge, S.M. Roberts, A.G. Sutherland R.J. Wisdom, Chem. Soc., Perkin Trans, 1991, 1:2276-2277 (b) R.C. Lloyd, M.C. Lloyd
M.E.B. Smith, K.E. Holt, J.E. Swift, P.A. Keene, S.J.C. Taylor, R. McCauge, Tetrahedron, 2004, 60:717-228
88 D-H Leng, D-X Wang, Z-T Huang and M-X Wang, Org. Biomol. Chem., 2010, 8:4736''4743 89 R. Brieva, J.Z. Crich, C.J. Sih, J. Org. Chem., 1993, 58:1068-1075 Raymond J. Cvetovich 90 con l''utilizzo di una lipasi hanno prodotto l'' (S)-3,3-diethil-4-(4''-carbossifenossi)-2- azetidinone con una resa del 60% in tre cicli ed un 93% di eccesso enantiomerico.
1.4.1. Sintesi di derivati desimmetrizzati dell''acido β glutammico: apertura chemo- e stereo-selettiva di 4-
carbonilmetiliden-2 azetidinoni
Presso il gruppo di ricerca presso cui ho svolto il mio dottorato abbiamo messo a punto la sintesi di derivati
4-carbonil-2-azetidinonici a partire dal substrato commerciale 4-acetossi 2-azetidinone utilizzando la
reazione di Reformatsky, con l''obiettivo di utilizzarli come sintoni per la sintesi di derivati β amminoacidici
tramite strategie biocatalitiche
La reazione di Reformatsky 91 è stata osservata già nel 1887 fra l''acetone e l''estere etilico dell''acido iodoacetico, in presenza di zinco metallico: la reazione di Reformatsky è oggi molto più generale e contempla
infatti l''attacco metallo-indotto di α-alocarbonili su un range di elettrofili estremamente vario, con reazioni
di sostituzione elettrofila o addizione nucleofila. La reazione avviene generalmente in due step: nel primo
viene sintetizzato il reattivodi Reformatsky tramite addizione ossidativa dello zinco ad un α-alocarbonile
(generalmente un α-Bromo o α-Iodo estere) e nel secondo viene messo a reagire con l''opportuno partner
elettrofilo. X O O R XZn O O R Zn R1 R2 O O O R R1 OH R2 Un fattore importante per ottenere un buon risultato è relativo alla natura dello zinco metallico: deve essere
per esempio sempre attivato per rimuovere la patina di ossido presente a livello superficiale, utilizzando
generalmente una piccola percentuale di TMSCl, oppure un po'' di I2 o 1,2-dibromoetano. In alcuni casi lo
zinco viene preparato in situ per riduzione dei suoi sali metallici.
La reazione di Reformatsky sul 4-acetossi-azetidin-2-one è stata ottimizzata e prevede la primaria
formazione del reattivo di organozinco partendo da un α-bromo acetato che poi a contatto con il β lattame
provoca la sostituzione nucleofila dell''acetato. In particolare in una soluzione di THF, si sospende Zinco
metallico e lo si attiva con TMSCl: successicamente si goccola l''α bromo acetato e poi dopo aver decantato e
aspettato la formazione dell''organo metallo, lo si trasferisce su di una soluzione di β lattame in THF a 0°. 90 R.J. Cvetovich, M. Chartrain, F.W. Hartner Jr, C. Roberge, J.S. Amato, and E.J.J. Grabowski, J. Org. Chem., 1996, 61:6575-6580
91 a) Reformatsky, S. (1887)., Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 20 (1): 1210''1211; b) Reformatsky, S. (1890). J. Russ. Phys. Chem.
Soc 22: 44 OR O OR O Zn, TMSCl NH O O O NH O O OR Br BrZn THF OR O BrZn THF (76% overall) R = Me, Et, tbu, Bn, Oct R = Me (54)
R = Et (10)
R = tbu (55)
R = Bn (56)
R = Oct (57) Il meccanismo di reazione ipotizzabile è il seguente :
O O Zn NH O O RO Br solvente NH O O OR O O ZnBr +
Si ipotizza che lo zinco coadiuvi l''uscita dell''acetato e contemporaneamente favorisca l''attacco nucleofilo del
carbanione .
Questi nuovi derivati β lattamici sono considerati ottimi precursosi (sintoni) dell''acido β glutammico
desimmetrizzato. Questa molecola è particolarmente costosa e non facilmente sintetizzabile in forma
desimmetrizzata enantiopura; è nota la sua attività biologica 92 e potenziale la sua attività come chelante asimmetrico di metalli.
HOOC COOR NH2 *
Le due funzioni carbossiliche dell''acido β glutammico desimmetrizzato derivano dall''estere e dall''apertura
del β lattame.
HOOC COOR NH2 NH O COOR * *
La strategia biocatalitica che abbiamo scelto è quella di utilizzare delle lipasi, esterasi e proteasi per
catalizzare l''apertura del β lattame o l''idrolisi della catena esterea in modo chemoselettivo ed
enantioselettivo, tramite un processo di risoluzione cinetica. Per quanto riguarda la chemoselettività e la
stereoselettività: ' chemoselettività: i substrati presentano due gruppi funzionali: un legame estereo sulla catena in 4 al β-lattame ed il legame ammidico del β-lattame.
L''idrolisi selettiva di uno dei due legami porta a prodotti diversi: se gli enzimi funzionano come
idrolasi si ottengono i corrispettivi derivati acidi od alcolici, mentre se operano come amidasi si
ottengono derivati β-amminoacidici chirali. 92 Watanabe, K.; Onozuka, M.; Niwa, M.; Pongchaidecha, A., General Pharmacology, Volume 22, issue 6 (1991), p. 1165-1168
' stereoselettività: i substrati sono ottenuti come miscela racema in cui il centro stereogenico si trova sul carbonio in 4 al β-lattame. Le idrolasi citate possono essere quindi in grado di discriminare i due
enantiomeri idrolizzandone uno rispetto all''altro ottenendo così una risoluzione cinetica.

Sono quindi stati effettuati diversi screening biocatalitici sui seguenti β lattami, scegliendo come enzimi la
CAL-A, la CAL-B, la PLE e l''α chimotripsina; la scelta degli enzimi è stata basata sulla recente letteratura
riguardante la risoluzione cinetica di β lattami.

La CAL-A e la CAL.B sono delle lipasi (E.C 3.1.1.1) molto versatili estratte dal micororganismo Candida
Antarctica. Sono enzimi coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e in grado quindi di idrolizzare i
trigliceridi. Hanno una struttura ''α/β-hydrolase fold' e in generale una specificità differente rispetto alla
PLC. Sono enzimi molto stabili ed entrambi sono stati utilizzati in forma immobilizzata. La CAL-A in
particolare risulta essere in grado di riconoscere preferenzialmente substrati molto ingombranti al contrario
di CAL-B, molto più aspecifica.
La PLE (Porcine o Pig Liver Esterase ) classificata come E.C. 3.1.1.1 è un enzima molto versatile ed è stata
impiegata intensivamente negli ultimi decenni come biocatalizzatore sia di reazioni di idrolisi sia di sintesi di
esteri, dato il suo costo poco elevato. ' un esterasi serina-dipendente e appartiene alla classe delle esterasi
degli esteri degli acidi carbossilici ed ha una struttura quaternaria trimerica composta dalle subunità α, β e γ
di circa 60 kDa di peso molecolare ciascuna, di cui le principali combinazioni sono ααα, ααγ e γγγ, per cui in
natura ne esistono diversi isoenzimi.
Il suo ruolo biologico è quello di idrolizzare i vari esteri presenti nella dieta del maiale, da qui probabilmente
deriva l'ampia specificità di substrato che caratterizza questo enzima.
Tuttavia sono presenti anche problemi che ne riducono il possibile utilizzo in processi industriali: innanzitutto
viene venduta come crudo di un estratto di fegato di maiale, per cui può contenere altre attività enzimatiche
diverse da quella esterasica o degli isoenzimi che potrebbero dare problemi di riproducibilità o di ''reazioni
parassita'.
La α-chimotripsina (E.C. 3.4.21.1) è una proteasi, cioè è un enzima che catalizza la rottura del legame
peptidico in presenza di amminoacidi idrofobici come la tirosina, il triptofano, la fenilalanina e la leucina in
quanto il sito catalitico, molto apolare e profondo, è in grado di alloggiare tali amminoacidi e contiene una
triade catalitica.
' un enzima digestivo ed assieme ad altri enzimi completa la digestione delle proteine: viene sintetizzato dal
pancreas in forma inattiva, detta chimotripsinogeno, in quanto sarebbe dannoso se si trovasse nella sua
forma attiva. Una volta rilasciato nell'intestino la tripsina scinde uno specifico legame peptidico generando
così la forma attiva della chimotripsina, detta '-chimotripsina, la quale agisce su se stessa idrolizzando due
frammenti peptidici di due amminoacidi, generando così la forma finale dell'enzima (α-chimotripsina)
formata da tre catene peptidiche tenute insieme da due ponti disolfuro.In termini applicativi l'utilizzo di
proteasi va a compensare lo scarso numero di esterasi in grado di idrolizzare esteri degli acidi carbossilici e
agendo su di essi sembrano preferire l'enantiomero che assomiglia di più un L-amminoacido, infatti il
requisito principale affinché un substrato sia idrolizzato selettivamente dalla α-chimotripsina è
rappresentato dalla presenza di un gruppo polare e di un gruppo idrofobico sul carbonio α , come avviene
appunto negli amminoacidi, substrati naturali dell''enzima.
Lo screening è stato fatto dissolvendo o sospendendo il β lattame nel solvente all''interno di una provetta,
cui è stato successivamente aggiunto l''enzima lasciando in agitazione su un orbital shaker. La reazione è
stata poi controllata tramite prelievi precisi e noti tramite HPLC e HPLC/chirale, verificando la conversione
e/o resa con retta di taratura.
Le prime prove di attività di questi enzimi nei confronti dei nostri substrati 4-carbonil 2 azetidinonici sono
state condotte su 54, 10 e 57, i β lattami esterificati cioè con alcoli primari. Sfortunatamente tutti questi
substrati, sia l''R che l''S, sono stati sempre idrolizzati ad acido β glutammico fino a completa conversione del
β lattame di partenza.
Sul substrato benzilico 56 hanno mostrato una grande attività degli enzimi testati su entrambi gli
enantiomeri (Tabella 6).
NH O COOBn NH (S) O COOH Enzima Buffer PBS / Solvente NH (R) O COOBn H2OOC COOBn NH2 HOOC COOH NH2 56 56 58 60 61 Tabella 6 Entry Enz. Q.tà PBS 0.1 M (pH) Solvente Organico (%) Conversione β-lattame (h) S/R Estratto Acquoso 1 CAL-A 30 (45) 7.5 \ 100 (1h) - (6)/(8) 2 CAL-A 10 (15) 7.5 \ 95 (1h) - (6)/(8) 3 CAL-B 15 (150) 7.5 \ 97 (24h) 32/68 (6)/(8) 4 CAL-B 15 (150) 7.5 \ 5 CAL-B 15 (150) 7.5 \ 6 PLE 10 (170) 7.5 \ 100 (1h) - (6)/(8) 7 PLE 2 (34) 7.5 \ 101 (1h) - -6 8 α-CHI 2 (84) 7.5 \ 41 (24h) 13/87 -6 9 α-CHI 2 (84) 7.5 \ 41 (24h) 13/87 -6 10 α-CHI 2 (84) 7.5 \ 41 (24h) 13/87 -6 11 α-CHI 2 (84) 7.5 \ 41 (24h) 13/87 -6 12 α-CHI 2 (84) 7.5 \ 41 (24h) 13/87 -6
Sia la CAL-A che la PLE si mostrano molto attivi nei confronti del substrato, portando già dopo poche ore il
substrato ad una conversione completa, anche se addizionati in minore quantità.L''attività della CAL-B risulta
essere invece più ridotta ma comunque poco selettiva in termini di risoluzione cinetica. L''aggiunta di
solvente organico, MeCN, aumenta ulteriormente la velocità di risoluzione cinetica dell''enzima peggiorando
il risultato (la risoluzione finisce dopo 1 ora). L''enzima che mostra la migliore selettività risulta essere l''α
chimotripsina, che in funzione di questo è stata studiata in maggior dettaglio. Le prime prove svolte in
tampone fosfato a pH 7,5 e in tampone fosfato addizionato al 10% di MeCN mostrano che la reazione in
solvente organico è più enantioselettiva. Abbiamo quindi effettuato altre prove variando il solvente: in un
primo caso abbiamo abbassato il pH a 7, osservando però un peggioramento della enantioselettività.
Abbiamo poi fatto 4 prove variando il solvente organico, osservando in generale un trend molto simile, ma
con i migliori risultati con l''acetone e con la DMF.
La configurazione è stata assegnata in funzione del segno dell''α di rotazione di una miscela enantioarricchita
di 56. 93 Dall''analisi dei risultati ottenuti su 56 si osserva che non si riesce con nessuno di questi enzimi ad arrivare ad una completa risoluzione cinetica, con il migliore valore ottenuto dall''enzima αchimotripsina. In
particolare si osserva che tutti questi enzimi sembrano mostrare una attività esterasica, essendo sempre il
prodotto 59 quello recuperato dalla fase acquosa: all''attività esterasica si aggiunge quella amidasica CAL- 93 N. Ikota, H. Shibata, K. Koga, Heterocycles, 1980, 14:1077-1080 A,CAL-B e PLE, poiché si recupera sempre l''acido β glutammico (61). E'' interessante notare come non sia mai
stato recuperato il prodotto 60.
Per verificare con più accuratezza l''estere benzilico, abbiamo effettuato uno screening di (CAL-B, PLE e α
chimotripsina) sull''analogo N-acilato con un gruppo Boc (per la procedura di acilazione, si veda il paragrafo
successivo). N O O O O O 62 I risultati in termini di conversione e resa ottenuti mostrano anche in questo caso la scarsa enantioselettività
nei confronti di questo substrato.

Il β lattame estere t-butilico 55 ha dato risultati molto interessanti in termini di eccesso enantiomerico.

NH O CO2tbu NH (S) O COOH Enzima Buffer PBS / Solvente NH (S) O COOtbu HOOC COOtbu NH2 HOOC COOH NH2 55 55 58 63 61 Tabella 7
Anche su questo susbtrato, sia CAL-A che CAL-B non hanno mostrato alcuna enantioselettività, convertendo
il β lattame racemo a 58 e a 61 senza alcuna discriminazione enantiomerica. L''α chimotripsina non ha
praticamente mostrato attività, mentre la PLE ha portato ad un ottimo risultato in termini di resa ed eccesso
enantiomerico, utilizzando unicamente il tampone fosfato come solvente. In particolare si è osservata la
completa risoluzione cinetica della miscela racemica, con un eccesso enantiomerico completo;
l''enantiomero non reagito risulta l''S da letteratura. 94 Inoltre nella fase acquosa è stato trovato solo 63, il prodotto di apertura del β lattame, la cui configurazione deve essere R (ma non è stata verificata). Questo
risultato mostra come la PLE, una esterasi, abbia in realtà esercitato una attività amidasic. La stessa reazione
provata in presenza di più enzima ha portato a risultati peggiori in termini di eccesso enantiomerico; l''utilizzo
di cosolventi al 10%, ha drammaticamente abbassato l''eccesso enantiomerico.
Lo stesso screening enzimatico sull''analogo β lattame N acilato con un gruppo CBZ, ha mostrato ottimi valori
di eccesso enantiomerico, ma utilizzando l''enzima CAL-B (Conversione = 58% (120h), S/R = 96/4).
Curiosamente, l''enzima PLE ha convertito tutta la miscela racemica senza enantiodiscriminazione.
N O O O O 64 O
Anche in questo caso, la configurazione del β lattame che non ha reagito è S, e l''attività esercitata
dall''enzima è sempre stata di natura ammidasica. 94 H. Yamashita, Chem. and Pharma. Bull., 1988, 36:469-480 Si è deciso di testare gli enzimi CAL-B e PLE anche sul 2-acetossi-4-azetidinone che si differenzia dai gli esteri
precedenti per la mancanza di un CH2 nella catena laterale in 4 all''anello β-lattamico e per avere un legame
diretto C-O con l''anello e quindi presenta un gruppo acilico più corto.
In tutti questi casi si è osservata la scomparsa molto veloce dello starting material e dall''analisi dell''estratto
acquoso è stata chiara la presenza e l''ottenimento del fosfo β lattame qua sotto rappresentato. Per
verificare se in qualche modo la reazione fosse catalizzata dall''enzima, il β lattame è stato dissolto in
tampone fosfato senza enzimi: ma anche in questo caso, è stata osservata la formazione del legame con il
gruppo fosfato.
NH O OAc tampone fosfato 0.1 M ph 7.5 NH O O P O OH HO + CH3COOH 65
La nostra ipotesi è che subentri una semplice sostituzione nucleofila, con uscita dell''acido acetico/acetato. La
verifica della presenza di questo gruppo è stata comunque confermata da analisi NMR al 31P ma soprattutto
dalla molteplicità del protone e del carbonio, che accoppiano con nucleo del fosforo (Si veda la parte
sperimentale). Questa molecola si caratterizza in effetti come un nuovo β lattame e sono tuttora in corsi
studi per razionalizzare la sua sintesi e le sue proprietà biologiche. In letteratura tra gli antibiotici antibiotici
contenenti il fosfato è molto famosa la fosfomicina, antibiotico che mimando la struttura del
fosfoenolpiruvato (PEP) inibisce l'enzima piruvato UDP-NAG transferasi e quindi del NAM del peptidoglicano
dei batteri. 95 . E'' tuttavia nota anche una peculiare classe di molecole, i β fosfolattami qui rappresentati. 96
L''approccio enzimatico all''apertura dei 4-carbonil-2-azetidinoni l''accesso a prodotti di apertura/idrolisi
enantiomericamente puri è stato efficace, come abbiamo appena visto, solo nel caso in cui il β lattame fosse
esterificato come estere t-butilico. E'' stato quindi messo a punto un approccio chimico alternativo e
generale per l''apertura chemoselettiva dell''anello β lattamico e l''ottenimento del acido β glutammico
desimmetrizzato chirale desiderato in forma racema. I 4-carbonil 2-azetidinoni prescelti sono stati il benzile
(56) e il terbutile (55).
Per rendere più chemoselettiva la reazione di apertura idrolitica del β lattame (idrolisi di una ammide)
rispetto a quella dell'' estere, i 2-azetidinoni sono derivatizzati sull''azoto con gruppi uretanici. La prima
reazione è stata l''acilazione dell''azoto β lattamico con l''opportuno derivato uretanico ortogonale al gruppo
estereo. 95 a) Patel SS, Balfour JA, Bryson HM, , Drugs 1997, 53 (4): 637''656; b) Grif K, Dierich MP, Pfaller K, Miglioli PA, Allerberger F (August 2001). The
Journal of antimicrobial chemotherapy 48 (2): 209''17
96 Afarinkia, K.; Cadogan, J. I. G.; Rees, C. W. J. Chem. Soc.,Chem. Commun. 1992, 285 NH O O O N O O O O O NH O O O N O O O O O LHMDSA, CbZ-Cl (BOC)2O, DMAP THF, -78°C and RT DCM, RT 55 56 62 64
L''acilazione risulta essere il punto chiave in quando porta il 2 azetidinone ad essere particolarmente
tensionato ed elettrofilo e pronoalla successiva reazione di di apertura. L''apertura di entrambi i β lattami
avviene in una miscela diossano/KOH acquoso a temperatura ambiente.
N O COOR1 COOR2 R1 = tbu, R2 = Bn (64) R1 = Bn, R2 = tbu (62) KOH Diossano, H2O HOOC COOR1 NHCOOR2 R1 = tbu, R2 = Bn (66) R1 = Bn, R2 = tbu (67)
La reazione procede molto bene per entrambi β lattami. Si ha poi la liberazione della protezione sull''azoto
per entrambi grazie a procedure note e si ha l''ottenimento dei mono glutammati.
HOOC COOtbu NHCOOBn HOOC COOBn NHCOOtbu HOOC COOtbu NH2 HOOC CHOOBn NH3 TFA TFA DCM, RT H2 Pd/C THF/MeOH 66 67 63 60










1.5 Parte sperimentale
Parte Sperimentale relativa al paragrafo 1.2.1

Parte Strumentale
Commercially available reagents were used as received without additional purification. 1H and 13C NMR
values were recorded on Inova 400, 300, or Gemini 200 instruments with a 5 mm probe. All chemical shifts
(d) are reported in ppm relative to deuterated solvent signals, and coupling constants (J) are reported in Hz.
FTIR: Thermo Nicolet 380 measured as films between NaCl plates, with wavenumbers reported in cm_1. TLC:
Merck 60 F254. Column chromatography: Merck silica gel 200''300 mesh. GC''MS: Agilent Technologies
MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, EI voltage: 70 eV, gradient from 50!2808C over 30 min,
column HP5 5% Ph-Me silicon. HPLC''MS: Agilent Technologies HP1100, column Zobrax-Eclipse XDB-C8
Agilent Technologies, mobile phase: H2O/ CH3CN, gradient from 30!80% CH3CN over 8 min, 80% CH3CN
until 25 min, flow rate: 0.4 mLmin_1 coupled with Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass
spectrometer, full-scan mode from m/z 50 to m/z 2600, scan time 0.1 s in positive ion mode, ESI spray
voltage: 4500 V, N2 gas at 240 kPa, drying gas flow rate: 11.5 mLmin_1, fragmentor voltage: 20 V. Elemental
analysis: Thermo Flash 2000 CHNS/O analyzer.

4-Alkyliden-azetidinones 1, 3, 5 and 8 are known and were prepared following the reported procedures.
Azetidinones 16 and 28 are commercially available. Azetidinones 10, 20, 24, 29, 30, and 32, and 18, 22, 26 and 34 are known.

Benzyl 2-(4-oxoazetidin-2-ylidene)-acetate (E)-7 and (Z)-9
Compounds 7 and 9 were obtained with the same procedure as 1 [9, 13] starting from the commercially available 4-acetoxy-azetidinone in 43% yield and in a E/Z mixture 41/59. The two isomers were separated by
flash-chromatography.

(E)-benzyl 2-(4-oxoazetidin-2-ylidene)acetate (7) white solid: Rf =0.5 (cyclohexane/EtOAc 5:5); mp: 98''103°C; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ=3.80 (d, J=1.2 Hz, 2H), 5.17 (s, 2H), 5.40 (d, J=1.2 Hz, 1H), 7.22 (bs, 1H), 7.30-
7.38 ppm (m, 5H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ=45.9, 65.9, 91.8, 128.0, 128.1, 128.5, 135.9, 151.6, 166.3, 166.5 ppm; IR (KBr): ṽ=3193, 1827, 1698, 1639, 1284, 1046 cm -1; HPLC-MS, (ESI): Rt=6.40 min, m/z (%): 200 (90), 218 (38) [M+H] +, 240 (100) [M+Na]+; Anal. calcd. for C12H11NO3 C 66.35, H 5.10, N 6.45, found: C 66.28, H 5.01, N 6.32.
(Z)-benzyl 2-(4-oxoazetidin-2-ylidene)acetate (9) white solid: Rf=0.8 (cyclohexane/EtOAc 5:5); mp:167-165°C; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ=3.55 (d, J=0.9 Hz, 1H), 3.56 (d, J=0.9 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 5.24 (dd, J=0.9
Hz, J=0.6 Hz, 1H), 7.30-7.39 (m, 5H), 8.59 ppm (brs, 1H); 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ=44.9, 66.0, 90.3, 128.1, 128.3, 128.6, 135.9, 150.3, 164.5, 166.8 ppm; IR (KBr):
ṽ=231, 1825, 1687, 1642, 1251, 1141 cm -1; HPLC-MS, (ESI): Rt=6.87 min, m/z (%): 218 (12) [M+H] +, 236 (15) [M+H2O+H]+, 262 (100), 278 (42); Anal. calcd. for C12H11NO3 C 66.35, H 5.10, N 6.45, found: C 66.31, H 4.99, N 6.34. General procedure for the N-methylthiolation reaction
To a solution of β-lactam N-1 unsubstituted (1 mmol) in THF (10 mL) at -78° C under inert atmosphere was
added a freshly prepared LDA 1M solution in THF (or LiHMDSA) 110 µL (1.1 mmol) and then S-methyl
methanethiosulfonate (236 µL, 2.5 mmol). The solution was allowed to warm at room temperature and
monitored by TLC. After 4 hours the reaction was quenched with aqueous NH4Cl (10 mL) and extracted with
EtOAc (3x10 mL). The organic extracts were dried over Na2SO4, filtered and concentrated in vacuo. Flash
chromatography of the extracts gave the N-thiomethyl β-lactams.

(E
)-ethyl 2-((S)-3-((1R)-1-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2- ylidene)acetate (2): NH O O O NH O O O Obtained with LDA. Transparent oil (215 mg, 60% yield): Rf=0.8 (cyclohexane/EtOAc
9:1); [α] D 25=+93.3 (c=0.84 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=0.09 (s, 3H), 0.11 (s, 3H), 0.90 (s, 9H), 1.18 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.30 (t, J=7.4 Hz, 3H), 2.48 (s, 3H), 4.20 (q,
J=7.4 Hz, 2H), 4.64 (dq, J=6.6, 4.0 Hz, 1H), 4.22 (m, 1H), 5.62 ppm (d, J=1.0 Hz, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=''4.8, -4.6, 14.4, 18.0, 19.8, 21.6, 25.7, 60.1, 65.1, 65.9, 92.6,
157.0, 165.6, 169.3 ppm; HPLC-MS (ESI), Rt=24.35, m/z (%): 360 (100) [M+H] +, 382 (17) [M+Na] +; GC-MS (EI, 70 ev): Rt=23.29, m/z (%): 73 (85), 103 (30), 115 (32) 159 (28), 302 (100), 315 (39); IR (film): ṽ=2952, 2926, 2853, 1825, 1713, 1660, 1255, 1162, 1063, 831 cm -1; Anal. calcd. for C16H29NO4SSi: C 53.45, H 8.13 N 3.90, S 8.92, found: C 53.54, H 8.16, N 3.83, S 8.78.

(E
)-benzyl 2-((S)-3-((1R)-1-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2- ylidene)acetate (4): Obtained with LDA. Transparent oil (181 mg, 43%: yield): Rf=0.9
(cyclohexane/EtOAc 9:1); [α] D 25=+69.1 (c=0.73 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=0.07 (s, 3H), 0.08 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 1.17 (d, J=6.2 Hz, 3H), 2.48 (s,
3H), 4.21 (dd, J=4.0, J=1.0 Hz, 1H), 4.62 (dq, J=6.2, J=4.0 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H),
5.68 (d, J=1.0 Hz, 1H), 7.35-7.39 ppm (m, 5H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3,): δ=''5.1, -4.9, 17.8, 19.7, 21.4, 25.6, 64.9, 65.8, 65.9, 92.1, 128.0, 128.1, 128.5, 135.9,
157.7, 165.4, 169.1 ppm; IR (film): ṽ=2955, 2929, 2895, 2856, 1825, 1714, 1661,
1256, 1157, 1057, 831 cm -1; HPLC-MS (ESI), Rt=12.87 min, m/z (%): 422 [M+H]+, 440 [M+Na] +, 460 [M+K]+; Anal. calcd. for C21H31NO4SSi C 59.82, H 7.41, N 3.32, S 7.61; found: C 59.69, H 7.38, N 3.24, 7.49.

(E
)-Ethyl 2-(1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-ylidene)acetate (6): Obtained with LiHMDSA. Transparent oil (66 mg, 33% yield): Rf=0.7 (cyclohexane/EtOAc
5:5); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=1.30 (t, J=7.2 Hz, 3H), 2.51 (s, 3H), 3.89 (d, J=1.2 Hz, 2H), 4.20 (q, J=7.2 Hz, 2H), 5.65 ppm (dd, J=1.2, J=1.4 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ=14.3, 21.6, 46.8, 60.2, 92.5, 155.0, 166.0, 168.4 ppm; IR (neat): ṽ=2958, 2923, 1810, 1702, 1660,
1057, 835 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=6.38 min, m/z (%): 156 (82) [M-OEt]+, 174 (46), 202 (100) [M+H] +; Anal. calcd. for C8H11NO3S: C 47.75, H 5.51, N 6.96, S 15.93, found: C 47.67, H 5.48, N 6.84, S 15.78.

Ethyl 2-(1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl)acetate (11): Obtained with LiHMDSA. Transparent oil (67 mg, 33% yield): Rf=0.3 (CH2Cl2/acetone
98:2); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ=1.30 (t, J=7.2 Hz, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.57 (dd, J=15.9, 7.8 Hz, 1H), 2.85 (dd, J=15.0, J=2.7 Hz, 1H), 2.90 (dd, J=15.9, J=5.4 Hz, 1H), 3.27 (dd,
J=15.0, J=5.4 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 4.20 ppm (q, J=7.2 Hz, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=14.1, 22.4, 38.0, 44.3, 51.8, 61.0, 169.8, 170.1 ppm; IR (neat): ṽ = 2922, 2852, 1763, 1735, 1420, 1319, 1260 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=3.73 min, m/z (%): 162 (100) [M-CH2CO+H]+ , 204 (32) [M+H] +, 226 (35) [M+Na]+; GC-MS (EI, 70 ev): Rt = 16.18 min, m/z (%): 61 (27), 72 (30), 86 (77), 88 (75), 89 (74), 114 (22),116 (23), 141 (100), 161 (71) [M-COCH2] +, 203 (11) [M]+; Anal. calcd. for C8H13NO3S: C 47.27, H 6.45, N 6.89, S 15.78, found: C 47.16, H 6.36, N 6.70, S 15.69.

Ethyl
((3S,2R)-3-((1R)-1-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl)acetate (12): Obtained starting from 34 with LDA. Transparent oil (267 mg, 74% yield): Rf=0.8
(cyclohexane/EtOAc 8:2); [α] D 25=+71.3 (c=1.3 in CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3,): δ=0.03 (s, 3H), 0.04 (s, 3H), 0.83 (s, 9H), 1.13 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.26 (t, J=7.2 Hz, 3H),
2.38 (s, 3H), 2.57 (dd, J=15.0, J =6.6 Hz, 1H), 2.77 (dd, J=15.0, J=6.0 Hz, 1H), 2.99 (dd,
J=3.3, J=3.0 Hz, 1H), 4.13-4.20 (m, 1H), 4.15 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.20 ppm (dq, J = 6.3, J=3.3 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=-5.0, -4.6, 14.0, 17.8, 22.6, 22.5, 25.6, 37.9, 53.7, 60.8, 64.3, 64.8, 170.2, 170.8 ppm; IR (neat): ṽ=3019, 2956, 2930, 2857, 1763, 1734, 1265, 1216, 838 cm -1; GC-MS (EI, 70 ev): ): Rt = 23.90 min, m/z (%): 73 (90), 75 (100), 103 (35), 143 (35), 304 (100); Anal. calcd. for C16H31NO4SSi: C
53.15, H 8.64, N 3.87, S 8.87; found: C 53.12, H 8.76, N 3.89, S 8.79.



N O OTBS O O SMe N O OTBS O O SMe N O O O SMe N O O O SMe N O OTBS SMe COOEt (2R,3R)-3-((1R)-1-(Tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl acetate (17): Obtained with LDA. Transparent oil (100 mg, 30% yield): Rf=0.9 (CH2Cl2/acetone 98:2);
[α] D 25=+7.0 (c=1.4 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=0.03 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0.84 (s, 9H), 1.23 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.45 (s, 3H), 3.18 (dd, J=3.0, J=1.6 Hz, 1H), 4.22 (dq,
J= 6.2, J=3.0 Hz, 1H), 6.22 ppm (d, J=1.6 Hz, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=-5.1, -4.5, 17.9, 21.0, 22.2, 22.8, 25.7, 64.0, 66.3, 80.2, 169.3, 169.8 ppm; IR (film): ṽ=2929, 2857, 1793,
1752, 1252, 1066, 838 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=17.69, m/z (%): 274 (100) [M-CH3COO]+, 290 (26) [M-CH3CO] +, 356 (9) [M+Na]+; GC-MS (EI, 70 ev): Rt=17.69, m/z (%): 234 (75), 190 (100), 117 (46), 75 (45); Anal. calcd. for C14H27NO4SSi: C 50.42, H 8.16, N 4.20, S 9.61, found: C 50.29, H 8.09, N 4.18, S 9.47.

S
-(2R,3S)-3-((1R)-1-tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl ethanethioate
(21):
sss Obtained with LiHMDSA. Transparent oil (230 mg, 66% yield): Rf=0.8 (cyclohexane/EtOAc
7:3); [α] D 25=+45.2 (c=1.7 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 1.17 (d, J=6.2 Hz, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 3.29 (dd, J=3.4, J=2.6 Hz, 1H),
4.26 (dq, J=6.2, J=3.4 Hz, 1H), 5.62 ppm (d, J=2.6 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=-5.1, -4.6, 17.8, 22.0, 22.2, 25.6, 30.9, 59.0, 64.4, 65.3, 169.4, 193.5 ppm; IR (film): ṽ=2929, 2986, 2956, 1782, 1707, 1252, 1127, 836 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=10.70 min, m/z (%): 372 (100) [M+Na]+, 721 (50) [2M+Na] +; Anal. calcd. for C14H27NO3S2Si: C 48.10, H 7.78, N 4.01, S 18.35, found: C 48.18, H 7.84, N 3.89, S 18.31.

(3S,4R)-3-((1R)-1-(tert-butyldimethylsilanyloxy)ethyl)-1-(methylthio)-4-(phenylsulfonyl)-azetidin-2-one
(25):
Obtained with LHMDSA. Pale yellow oil (365 mg, 88% yield): Rf =0.7 (cyclohexane/EtOAc
7:3); [α] D 25=-75.0 (c=1.2 in CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=0.01 (s, 3H), 0.03 (s, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.90 (d, J=6.0 Hz, 3H), 2.52 (s, 3H), 3.47 (dd, J=4.0, J=2.4 Hz, 1H), 4.24 (dq,
J=6.0, J=4.0 Hz, 1H), 4.83 (d, J=2.4 Hz, 1H), 7.62-7.66 (m, 2H), 7.72-7.76 (m, 2H), 7.97-
8.00 ppm (m,1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=-5.1, -4.8, 17.7, 21.9, 22.9, 25.6, 63.0, 63.7, 73.0, 129.1, 129.5, 134.7, 136.3, 169.1 ppm; IR (neat): ṽ=3066, 2955, 2929, 2857, 2481, 1792, 1326,
1153, 835 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt = 12.24, m/z (%): 116 (69) [M-SO2Ph]+, 309 (30), 372 (69), 433 (100) [M+H2O] +, 854 (10) [2M+Na]+; Anal. calcd. for C18H29NO4S2Si: C 52.01, H 7.03, N 3.37, S 15.43, found: C 52.19, H 7.08, N 3.39, S 15.23.

S-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl ethanethioate (31): Obtained with LiHMDSA. Transparent oil (59 mg, 31% yield): Rf=0.8 (cyclohexane/EtOAc 6:4); 1H NMR (200 MHz, CDCl3,): δ=2.45 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 3.12 (dd, J=15.4, J=3.0 Hz, 1H), 3.58
(dd, J=15.4, J=5.6 Hz, 1H), 5.50 ppm (dd, J=5.6, J=3.0 Hz, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=22.4, 31.0, 45.5, 57.9, 167.2, 193.8 ppm; IR (neat): ṽ=2918, 1773 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=4.03 min, m/z (%): 116 (100) [M-SAc] +, 134 (61), 192 (26) [M+H]+, 214 (35) [M+Na]+; Anal. calcd. for C6H9NO2S2: C 37.68, H 4.74, N 7.32, S 33.53, found: C 37.74, H 4.81, N 7.26, S 33.21.

1-(methylthio)-4-(phenylsulfonyl)azetidin-2-one (33):
Obtained with LiHMDSA. Pale yellow oil (203 mg, 79% yield): Rf=0.6
(Dichloromethane/acetone 98:2); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=2.52 (s, 3H), 3.30 (d, J=4.0 Hz, 2H), 4.74 (t, J=4.0 Hz, 1H), 7.58-7.79 (m, 3H), 7.92-7.98 ppm (m, 2H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=22.8, 42.0, 71.0, 129.1, 129.6, 134.9, 135.8, 167.3; IR (neat): ṽ=3063, 2964, 1781,
1584, 1309, 1149, 722 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=4.27 min, m/z (%): 116 (67) [M-SO2Ph]+, 125 (100) [PhSO] +, 258 (72) [M+H]+, 280 (70) [M+Na]+; Anal. calcd. for C10H11NO3S2: C 46.67, H 4.31, N 5.44, S 24.92, found: C 46.54, H 4.24, N 5.38, S 24.78.

Deprotection of the tert-butyldimethylsilanyloxy group.
To a solution of β-lactam (1.5 mmol) in CH3CN (15 mL) at 0° C under inert atmosphere was added BF3.Et2O
(226 µL, 1.8 mmol) and the reaction allowed to warm to room temperature and monitored by TLC. The
reaction was quenched with a 0.1 M phosphate buffer at pH 6 (15 mL) and extracted 3 times with CH2Cl2
(3x15 mL). The organic extracts were dried (Na2SO4), filtered and concentrated in vacuo. Flash
chromatography of the extracts gave the deprotected β-lactam. (E)-benzyl 2-((S)-3-((R)-1-hydroxyethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazeti din-2-ylidene)acetate (13): N O OTBS OAc SMe N O OTBS SAc SMe N O OTBS SO2Ph SMe N SAc O SMe N SO2Ph O SMe Transparent oil (419 mg, 91% yield): Rf=0.4 (cyclohexane/EtOAc 9:1); [α] D 25=+36.3 (c=0.78 in CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ=1.39 (d, J=6.0 Hz, 3H), 2.50 (s, 3H), 4.13 (d, J=7.8 Hz, 1H), 4.25 (m, 1H), 5.13 (brs, 1H), 5.21 (s, 2H), 5.79 (s, 1H), 7.37-
7.41 ppm (m, 5H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=20.9, 21.6, 66.2, 66.6, 66.9, 92.7, 128.5, 128.7, 135.4, 159.3, 167.4, 168.5, 834 ppm; IR (film): ṽ=3400, 3010, 1820,
1699, 1652, 1274, 1162, 1067 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=11.24, m/z (%): 308 (100) [M+H] +; Anal. calcd. for C15H17NO4S: C 58.61, H 5.57, N 4.56, S 10.43, found: C 58.74, H 5.66, N 5.48, S 10.38.
(2R
,3R)-3-((1R)-1-hydroxyethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl acetate (19): Transparent oil (263 mg, 80% yield): Rf=0.3 (cyclohexane/EtOAc, 5/5); [α] D 25=-33.3 (c=1.8 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=1.33 (d, J=6.2 Hz, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.22 (brs, 1H, OH), 2.51 (s, 3H), 3.21 (dd, J=1.6 Hz, J=6.4 Hz, 1H), 4.18 (quintet, J=6.4 Hz, 1H), 6.01 ppm (d,
J=6 Hz, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=20.9, 21.0, 22.8, 64.2, 66.7, 82.1, 168.5, 170.7 ppm; IR (film): ṽ=3458, 2974, 2924, 1781, 1752, 1229, 1040 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=min 2.45, m/z (%): 116 (100), 242 (45) [M+Na] +, 461 (10) [2M+Na]+; Anal. calcd. for C8H13NO4S: C 43.82, H 5.98, N 6.39, S 14.92, found: C 43.69, H 5.88, N 6.37, S 14.81.

S-(2R,3S)-3-((1R)-1-hydroxyethyl)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-2-yl ethanethioate (23):
Transparent oil (349 mg, 99% yield): Rf=0.3 (cyclohexane/EtOAc 6/4); mp: 100-103°C;
[α] D 25=+19.8 (c=2.4 in CHCl3); 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ=1.30 (d, J=6.6 Hz, 3H), 2.45 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 3.36 (dd, J=5.4 Hz, J=2.7 Hz, 1H), 4.27 (dq, J=6.6 Hz, 5.4 Hz, 1H), 5.52 ppm
(d, J=2.7 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ=20.9, 22.3 31.0, 60.1, 64.4, 66.0, 169.5, 194.3 ppm; IR (film): ṽ=3402, 1753, 1695, 1130 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=2.19 min, m/z (%): 116 (100), 192 (20) [M-COCH3] +, 236 (15) [M+H]+, 258 (28) [M+Na]+, 493 (9) [2M+Na]+; Anal. calcd. for C8H13NO3S2: C 40.83, H 5.57, N 5.95, S 27.25, found: C 40.89, H 5.68, N 5.91, S 27.18.

(3S,4R)-3-((1R)-1-hydroxyethyl)-1-(methylthio)-4-(phenylsulfonyl) azetidin-2-one (27): White solid (406 mg, 90% yield): Rf=0.4 (cyclohexane/EtOAc 5:5); mp: 167-169°C; [α] D 25 =-107.4, (c=1.7 in CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ=1.14 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.85 (d, J=4.4 Hz, 1H), 2.48 (s, 3H), 3.59 (dd , J=3.2 Hz, 2.8 Hz, 1H), 4.30 (ddq, J=6.8 Hz, J=4.4 Hz,
J=3.2 Hz, 1H), 4.86 (d, J=2.8 Hz, 1H), 7.62-7.66 (m, 2H), 7.73-7.77 (m, 1H), 7.97-8.00 ppm
(m,1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=21.4, 22.4, 62.2, 63.4, 72.7, 129.2, 129.6, 134.8, 136.2, 169.7 ppm; IR (KBr): ṽ=3433, 2979, 2925, 1763, 1647, 1310, 1147 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=4.90 min, m/z (%): 116 (15) [M-SO2Ph] +, 319 (100) [M+H2O]+, 625 (72) [2M+Na]+; Anal. calcd. for C12H15NO4S2: C 47.82, H 5.02, N 4.65, S 21.28; found: C 47.79, H 4.95, N 4.54, S 20.88.

(R
)-1-((S,E)-2-(2-(benzyloxy)-2-oxoethylidene)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl 4-hydroxybenzoate
(14):
To a solution of p-hydroxy benzoic acid (54 mg, 0.39 mmol) in CH2Cl2 (6 mL)
under inert atmosphere was added oxalylchloride (66 µL, 0.78 mmol). The
solution was refluxed for 2 hours; after removal of CH2Cl2 was introduced
13 (58 mg, 0.19 mmol), benzene (4 mL), SnCl4 1 M in CH2Cl2 (9.7 µL, 0.0097
mmol) and the mixture was refluxed for 2.5 hours and followed by TLC.
After completion the reaction was washed with 10 mL of 5% NaHCO3,
extracted with ethyl acetate (2x10 mL) and CH2Cl2 (2x10 mL), dried on Na2SO4 and concentrated in vacuo. Flash chromatography (cyclohexane/ethyl acetate 8/2) of the extracts
gave 14 (44 mg, 54% yield). Rf = 0.7 (cyclohexane/EtOAc 8:2); [α] D 25=+93.0 (c=0.84 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=1.35 (d, J=6.6 Hz, 3H), 2.52 (s, 3H), 4.55 (dd, J=4.8 Hz, J=1.5 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.75 (d, J=1.5
Hz, 1H), 5.87 (dq, J=6.6 Hz, J=4.8 Hz, 1H), 6.34 (bs, 1H, OH), 6.86-6.90 (m, 2H, Ar), 7.27-7.43 (m, 5H, Ar), 7.96-
8.00 ppm (m, 2H, Ar); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ=15.5, 21.7, 62.7, 66.4, 66.6, 93.3, 115.2, 122.2, 128.5, 128.6, 132.2, 135.7, 156.1, 160.2, 165.2, 168.8 ppm; IR (film): ṽ=3392, 1817, 1702, 1825, 1713, 1668, 1061
cm -1; HPLC-MS (ESI), Rt=12.94, m/z (%): 290 (100) [M-COOPh(OH)]+, 428 (20) [M+H]+, 450 (20) [M+Na]+, 877 (50) [2M+Na] +; Anal. calcd. for C22H21NO6S: C 61.81, H 4.95, N 3.28, S 7.50, found: C 61.70, H 4.88, N 3.25, S. 7.41.

(R
)-1-((S,E)-2-(2-(benzyloxy)-2-oxoethylidene)-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl 4-hydroxy-3,5- dimethoxybenzoate (15) N O OH O O SMe N O OH OAc SMe N O OH SAc SMe NSMe O OH SO2Ph N O O SMe O HO COOBn Compound 15 was obtained with the same procedure as 14 using
syringic acid (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid).
(15): Transparent oil (6.5 mg, 7% yield): Rf=0.8 (cyclohexane/EtOAc 8:2);
[α] D 25=+63.3 (c=1.01 in CHCl3); 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ=1.36 (d, J=6.6 Hz, 3H), 2.52 (s, 3H), 3.97 (s, 6H), 4.55 (dd, J=5.2, 1.4 Hz, 1H), 5.19
(d, JAB=12.4 Hz, 1H), 5.26 (d, JAB=12.4 Hz, 1H), 5.75 (d, J=1.4 Hz, 1H), 5.89
(dd, J=6.6 Hz, 5.2 Hz, 1H), 5.93 (bs, 1H, OH), 7.32-7.42 ppm (m, 7H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=15.5, 21.7, 56.4, 62.7, 66.3, 66.9, 93.3, 106.9, 120.9, 128.3, 128.5, 128.6, 135.8, 139.3, 146.6, 156.0, 165.0, 165.1, 168.4 ppm; IR (film): ṽ=3403, 2923, 1819,
1713, 1653, 1335, 1222, 1063 cm -1 HPLC-MS (ESI): Rt=13.05, m/z (%): 290 (100) [M-COOPh(OCH3)2(OH)]+, 488 (10) [M+1] +, 510 (15) [M+Na]+, 998 [2M+Na]+; Anal. calcd. for C24H25NO8S: C 59.13, H 5.17, N 2.87, S 6.58, found: C 58.95, H 5.08, N 2.81, S 6.44.


Analisi Microbiologiche
Ceppi batterici
A total of 77 clinical isolates were used for the in vitro antibacterial activity determination of the studied
compounds. The following Gram-positive and Gram-negative bacterial species were included: S. pyogenes
(7), S. pneumoniae (10), Enterococcus faecalis (3), methicillin-resistant S. aureus (MRSA) (13), methicillin
susceptible S. aureus (MSSA) (13), S. epidermidis (6), H. influenzae (4), E. coli (7), P. mirabilis (4), S.
marcescens (2), and K. pneumoniae (8).
Ten isolates from each group of MSSA and MRSA strains tested, had been recently isolated from paediatric
patients with cystic fibrosis at the Department of Paediatrics, CF Center, Foundation IRCCS CA' GRANDA
Ospedale Maggiore Policlinico, University of Milan.
All the isolates were well characterized for their antibiotic susceptibility pattern. Furthermore, MSSA and
MRSA strains isolated from CF patients are presently being evaluated for SCV phenotype, biofilm production
and the presence of molecular determinants of resistance.

Determinazione della MIC
The "in vitro" antibacterial activity of new compounds was studied by determining the Minimum Inhibitory
Concentrations (MICs) by means of the broth microdilution method, according to the CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute) [24] Briefly, serial two-fold dilutions of each antibiotic stock solution were obtained using Mueller-Hinton broth
in 96 wells microtitre plates. An equal volume of bacterial inoculum (5x10 5 CFU/mL) was added to each well of the microtitre plate containing 0.05 mL of serial antibiotic concentrations. The microtitre plate was then
incubated at 35 °C for 16-20 h; subsequently each well was analyzed for the presence of visible bacterial
growth. MIC was defined as the lowest concentration of the tested compound able to inhibit visible growth
of the microorganism, after overnight incubation. MIC50 and MIC90 were the concentrations required to
inhibit the growth, respectively, of 50% and 90% of the tested microorganisms.
The "in vitro" antibacterial activity of 33 new monocyclic azetidin-2-ones was tested and compared to that of
reference β-lactam agents in clinical use: amoxicillin (Sigma-Aldrich) and ceftriaxone (Sigma-Aldrich).
MSSA S. aureus ATCC 29213, MRSA S. aureus ATCC 43300, S. pyogenes ATCC 19615, E. coli ATCC 25922 were
used as controls for MIC determinations. Parte Sperimentale relativa al paragrafo 1.2.2 Parte Strumentale 1H and 13C NMR values were recorded on a INOVA 400, or a GEMINI 200 instrument with a 5 mm probe. All
chemical shifts have been quoted relative to deuterated solvent signals, d in ppm and J in Hz. FT-IR: Nicolet
380 measured as films between NaCl, plates wavenumbers reported in cm-1. TLC: Merck 60 F254. Column
chromatography: Merck silica gel 200-300 mesh. GC-MS: Agilent Technologies, column HP5 5% Ph-Me Silicon
MS: Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, EI voltage 70 eV, gradient from
50 °C to 280 °C in 30 min. HPLC-MS, HPLC: Agilent Technologies H29100, column ZOBRAX-Eclipse XDB-C8
Agilent Technologies, mobile phase: H2O/CH3CN, gradient from 30% to 80% of CH3CN in 8 min, 80% of CH3CN
until 25 min, 0.4 mL/min MS: Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, full-scan
mode from m/z 50 to m/z 2600, scan time 0.1 s in positive ion mode, ESI spray voltage 4500 V, nitrogen gas N O O SMe O HO COOBn MeO OMe 35 psi, drying gas flow 11.5 mL/min, fragmentor voltage 20 V. Elemental analysis were performed on a
Thermo Flash 2000 CHNS/O Analyzer, and they were within ± 0.4 % of the theoretical values. A Shimadzu
UV-1601 PC spectrophotometer was used for spectrophotometric measurements.

Azetidinones 34, and 4, 17, 19, 29, 20, 22, 30, 31, were prepared as previously reported.

1-(methylsulfonyl)-4-oxoazetidin-2-yl acetate (36):
A 1 M solution of LiHMDSA (1.1 mL, 1.1 mmol) was added to a solution of 4-acetoxy-2-
azetidinone (129 mg, 1.0 mmol) in THF (10 mL) at -78 °C under inert atmosphere, followed
by methansulfonyl chloride (194 µL, 2.5 mmol). The solution was allowed to warm to
room temperature and was monitored by TLC. After 3 h the reaction was quenched with aqueous NH4Cl (15 mL) and extracted with EtOAc (3x10 mL). The organic extracts were dried over Na2SO4
and the residue was purified by flash-chromatography (cyclohexane/ethylacetate: 60/40) to afford product
36 (42 mg, 20%) as a pale yellow oil. Found C, 34.92; H, 4.51; N, 6.90; S, 15.32%. C6H9NO5S requires C, 34.78;
H, 4.38; N, 6.76; S, 15.48%; νmax/cm -1 2970, 2917, 1757 and 1161. δH (400 MHz, CDCl3) 2.17 (3 H, s, CH3CO2), 3.10 (1 H, dd, J =2.0 and 16.4 Hz, CHCHH), 3.23 (3 H, s, SO2CH3), 3.54 (1 H, dd, J =4.8 and 16.4 Hz, CHCHH),
6.47 (1 H, dd, J = 2.0 and 4.8 Hz, CHCHH). δC (100 MHz, CDCl3) 20.7, 42.5, 45.7, 75.6, 161.0, 169.3. HPLC-MS
(ESI): Rt = 2.47 min, m/z: 225 [M + H2O] +, 230 [M + Na]+, 246 [M + K]+, 437 [2M + Na]+.
1-(methylthio)azetidin-2-one (35): LiHMDSA (2.2 mL 1M solution in THF, 2.2 mmol) was added to a solution of 2-azetidinone
(142 mg, 2 mmol) in THF (14 mL) at -78 °C under inert atmosphere, followed shortly by S-
methyl methanethiosulfonate (514 µL, 5 mmol). The solution was allowed to warm to room temperature and was monitored by TLC. After 3 h, the reaction was quenched with aqueous NH4Cl (15 mL)
and extracted with EtOAc (3 x 10 mL). The organic extracts were dried over Na2SO4 and the residue was
purified by flash-chromatography (cyclohexane/ethylacetate: 75/25) to afford product 35 (187 mg, 80%) as a
pale yellow oil. Found C, 40.83; H, 5.98; N, 11.87; S, 27.15 %; C4H7NOS requires C, 41.00; H, 6.02; N, 11.95; S,
27.37%; νmax/cm -1 2970, 2917, 1757 and 1161. δH (200 MHz, CDCl3) 2.41 (3 H, s, SMe), 3.04 (2 H, t, J = 4.8 Hz, CH2), 3.40 (2 H, t, J = 4.8 Hz, CH2). δC (100 MHz, CDCl3) 21.9, 38.7, 43.0, 170.9. HPLC-MS (ESI): Rt = 1.97 min,
m/z: 118 [M + H] +, 135 [M + H2O]+, 140 [M + Na]+, 257 [2M + Na]+. GC-MS (EI, 70eV): Rt = 8.04 min, m/z: 117 (40%, M +), 75 (100, M '' COCH2), 60 (50, M '' COCH2 '' Me).
(R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl-4-(ethoxymethoxy)-3,5
dimethoxybenzoate (37):
To a solution of 19 (117 mg, 0.53 mmol), in CH2Cl2 (20 mL) at 0° C
under inert atmosphere, the acid 44 (216 mg, 0.84 mmol), DMAP
(13 mg, 0.11 mmol) and DCC (174 mg, 0.84 mmol were added). After
10 minutes the mixture was allowed to warm to room temperature.
After 70 hours the reaction was washed with cool water and
extracted with CH2Cl2 (3x15 mL). The collected organic phases were
dried on Na2SO4 and evaporated. The residue was treated with EtOAc and filtered. The solid was discarted whereas the solvent was evaporated and purified by flash-
cromatography (cyclohexane/EtOAc: 70/30) obtaining product 37 (177 mg, 73%) as a white syrup. Found C,
52.58; H, 5.94; N, 3.11; S, 6.89%; C20H27NO9S requires C, 52.51; H, 5.95; N, 3.06; S, 7.01%; [α]D 22 -3.25 (c 1.6 in CHCl3). νmax/cm -1 3323, 2926, 2850, 1789, 1755, 1716 and 1126. δH (400 MHz, CDCl3) 1.17 (3 H, t, J = 7.2 Hz, CH3CH2), 1.48 (3 H, d, J = 6.4 Hz, CH3CHOCO), 2.14 (3 H, s, CH3CO2), 2.47 (3 H, s, SCH3), 3.46 (1 H, dd, J = 1.2
and 6.4 Hz, CHCHO), 3.84 (2 H, q, J = 7.2 Hz, CH3CH2), 3.87 (6 H, s, 2 x OCH3), 5.20 (2 H, s, OCH2O), 5.43 (1 H,
quintet, J = 6.4 Hz, CH3CHO), 6.21 (1 H, d, J = 1.2 Hz, CHOAc), 7.22 (2 H, s, arom.). δC (50 MHz, CDCl3) 14.8,
18.2, 20.8, 22.8, 56.1, 64.1, 64.9, 66.9, 81.5, 96.4, 106.7, 125.1, 138.9, 153.0, 164.9, 167.3, 169.6. HPLC-MS
(ESI): Rt = 8.62 min, m/z: 475 [M + H2O] +.


N OAc O SO2Me N O SMe N O O SMe O O OAc MeO OMe O (R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl-4-hydroxy-3,5-dimethoxy benzoate (38): A stirred solution of 37 (76 mg, 0.17 mmol) in CH2Cl2 under inert
atmosphere was treated with aliquots of trifluoroacetic acid (12 µL, 0.17
mmol) every 15 minutes until the disappearing of the starting material.
After the completion of the reaction, the solvent and the trifluoroacetic acid
were evaporated to obtain 38 (55 mg, 81%) as a yellow oil. Found C, 51.03;
H, 5.37; N, 3.44; S, 7.89%; C17H21NO8S requires C, 51.12; H, 5.30; N, 3.51; S,
8.03%); [α]D 22 -36.3 (c 0.52 in CHCl3). νmax/cm-1 3412, 2938, 2850, 1783, 1756, 1711 and 1116. δH (400 MHz, CDCl3) 1.50 (3 H, d, J = 6.4 Hz, CH3CHOCO), 2.16 (3 H, s, CH3CO2), 2.49 (3 H, s,
SCH3), 3.48 (1 H, dd, J = 1.2 and 6.0 Hz, CHCHOCO), 3.94 (6 H, s, 2 x OCH3), 5.44 (1 H, quintet, J = 6.4 Hz,
CH3CHO), 5.97 (1 H, s, OH), 6.23 (1 H, d, J = 1.2 Hz, CHOAc), 7.26 (2 H, s, arom.). δC (100 MHz, CDCl3) 18.3,
20.8, 22.9, 56.4, 64.2, 66.7, 81.5, 106.7, 120.6, 139.5, 146.6, 165.2, 167.5, 169.7. HPLC-MS (ESI): Rt = 5.68
min, m/z: 417 [M + H2O] +, 422 [M + Na]+, 821 [2M + Na]+.
(R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl-3,4-bis((tert-butyldi
methylsilyl)oxy)benzoate (41)
: To a solution of 19 (121 mg, 0.55 mmol) in CH2Cl2 (8.2 mL), compound 47
(210 mg, 0.55 mmol) and DMAP (67 mg, 0.55 mmol) were added. The
mixture was then cooled to 0°C, EDC (105 mg, 0.55 mmol) was added and
the system was allowed to reach rt in 10 minutes. After 30h, the reaction
was quenched with water and some drops of HCl (1 M), extracted with
CH2Cl2, dried on Na2SO4 and evaporated. The sylilated intermediate 41
was obtained after flash-cromatography (CH2Cl2/Et2O 99/1) in 23% yield (73 mg) as an oil. [α]D 22 -13.8 (c 0.5 in CH2Cl2). νmax/cm-1 3427, 2930, 2858, 1793, 1758, 1719 and 1120. δH (400 MHz, CDCl3) 0.22 (6 H, s, SitBuMe2), 0.23 (6 H, s, SitBuMe2), 0.99 (9 H, s, SitBuMe2), 1.00 (9 H, s,
SitBuMe2), 1.47 (3 H, d, J = 6.0 Hz, CH3CHOCO), 2.17 (3 H, s, CH3CO2), 2.47 (3 H, s, SCH3), 3.47 (1 H, dd, J = 1.6
and 6.0 Hz; CHCHO), 5.45 (1 H, quintet, J = 6.0 Hz, CH3CHO), 6.26 (1 H, d, J = 1.2 Hz, CHOAc), 6.82-6.84 (1 H,
m, Ar), 7.46-7.49 (2 H, m, Ar). δC (50 MHz, CDCl3) -4.2, -4.1, -4.1, -4.0, 18.3, 18.4, 18.5, 20.9, 22.8, 25.8, 25.9,
64.1, 66.3, 81.0, 120.4, 122.3, 122.9, 123.6, 146.8, 152.0, 165.0, 167.5, 169.8. HPLC-MS (ESI): Rt = 26.6 min,
m/z: 601 [M + H2O] +, 606 [M + Na]+, 1190 [2M + Na]+.
(R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl3,4-dihydroxy benzoate (39): To a solution of 41 (47 mg, 0.08 mmol) in anydrous CH3CN (1.64 mL) under
inert atmosphere and at 0°C BF3'Et2O (23 µL, 0.182 mmol) was added
dropwise. After 30 minutes the ice-bath was removed, and after 45 minutes
at rt the reaction was quenched with a pH = 6 phosphate buffer solution 0.1M,
extracted with CH2Cl2, dried on Na2SO4 and evaporated. The crude was finally
triturated to afford the desired product 39 in 46%yield (13 mg) as a light
yellow oil. Found C, 50.96; H, 4.91; N, 3.96; S, 8.95 %. C15H17NO7S requires C, 50.70; H, 4.82; N, 3.94; S, 9.02%. [α]D 22 -13.7 (c 0.25 in CH2Cl2). νmax/cm-1 3371, 2983, 2929, 1781, 1761, 1713, 1602 and 1294. δH (400 MHz, CDCl3) 1.47 (3 H, d, J = 6.0 Hz, CH3CHOCO), 2.18 (3 H, s, CH3CO2), 2.47 (3 H, s,
SCH3), 3.49 (1 H, dd, J = 1.2 and 4.8 Hz; CHCHO), 5.46 (1 H, quintet, J = 6.0 Hz, CH3CHO), 6.28 (1 H, d, J = 1.2
Hz, CHOAc), 6.86 (1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.44 (1 H, dd, J = 2.0 and 8.4 Hz; Ar), 7.50 (1 H, d, J = 2.0 Hz, Ar). δC (50
MHz, CDCl3) 18.3, 20.9, 22.7, 64.0, 66.3, 80.8, 114.8, 116.5, 121.8, 123.5, 143.4, 149.2, 165.3, 168.2, 170.1.
HPLC-MS (ESI): Rt = 5.0 min, m/z: 373 [M + H2O] +, 378 [M + Na]+, 733 [2M + Na]+.
(E
)-(R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl-3-(3,4-bis
(ethoxymethoxy)phenyl)acrylate (42):
To a solution of 19 (68 mg, 0.31 mmol) in CH2Cl2 (11.6 mL),
compound 46 (145 mg, 0.49 mmol) and DMAP (7.6 mg, 0.06
mmol) were added. The mixture was then cooled to 0°C, DCC
(101 mg, 0.49 mmol) was added and the system was allowed
to reach r.t. in 15 minutes. After 65 h, the reaction was
quenched with water, extracted with CH2Cl2, dried on Na2SO4,
evaporated and triturated with AcOEt to separate dicycloexylurea precipitate. The solution was then evaporated and purified by flash-cromatography
(cyclohexane/etylacetate 90/10 to 80/20) to afford the product in 61% yield (94 mg) as an oil. Found C,
55.78; H, 6.32; N, 2.68; S, 6.30 %; C23H31NO9S requires C, 55.52; H, 6.28; N, 2.82; S, 6.44%. [α]D 22 -7.4 (c 0.84 N O O SMe O HO OAc MeO OMe N O O SMe O TBSO OAc TBSO N O O SMe O HO OAc HO N O O SMe OAc O O O O O in CH2Cl2). νmax/cm -1 3327, 2977, 2930, 1789, 1757, 1711, 1635, 1599, 1510, 1437, 1251 and 1159. δH (400 MHz, CDCl3) 1.21-1.28 (6 H, m, 2 x OCH2CH3), 1.44 (3 H, d, J = 6.4 Hz, CH3CHO), 2.17 (3 H, s, CH3CO2), 2.51 (3
H, s, SCH3), 3.42 (1 H, dd, J = 1.6 and 6.0 Hz; CHCHO), 3.74-3.81 (4 H, m, , 2 x OCH2CH3), 5.30 (2 H, s, OCH2O),
5.31 (2 H, s, OCH2O), 5.37 (1 H, quintet, J = 6.0 Hz, CH3CHO), 6.22 (1 H, d, J = 1.6 Hz, CHOAc), 6.25 (1 H, d, J =
16.0 Hz, CH=CHCO), 7.13 (1 H, dd, J = 2.0 and 8.0 Hz, arom), 7.19 (1 H, d, J = 8.0 Hz, arom), 7.37 (1 H, d, J =
2.0 Hz, arom), 7.53 (1 H, d, J = 16.0 Hz, CH=CHCO). δC (50 MHz, CDCl3) 15.0, 15.1, 18.3, 20.9, 22.7, 64.1, 64.5,
64.6, 66.1, 80.9, 93.8, 94.1, 115.5, 115.7, 116.0, 123.4, 128.4, 145.3, 147.5, 149.5, 165.9, 167.5, 169.8. HPLC-
MS (ESI): Rt = 9.9 min, m/z: 515 [M + H2O] +, 520 [M + Na]+, 1017 [2M + Na]+.
(E)-(R)-1-((2R,3R)-2-acetoxy-1-(methylthio)-4-oxoazetidin-3-yl)ethyl-3-(3,4-dihydroxy phenyl) acrylate (40): To a solution of 42 (94 mg, 0.19 mmol) in CH2Cl2 (23 mL) under inert
atmosphere aliquots of TFA (64.5 µL, 0.869 mmol) were added every
15 minutes until the disappearing of the starting material (TLC
monitoring). The solution was evaporated and the crude was purified
by flash-cromatography (cyclohexane/ethylacetate 40/60). The
product obtained from the collected fractions was finally triturated
with pentane to afford the desired product 40 as a white solid in 90% yield (65 mg). Found C, 53.89; H, 5.13, N 3.55; S, 8.37 %; C17H19NO7S requires C, 53.53; H, 5.02; N, 3.67; S,
8.41%; mp: 53-58 °C. [α]D 22 -19.3 (c 1.11 in CH2Cl2). νmax/cm-1 3391, 2933, 1755, 1716, 1605, 1515, 1445, 1397, 1260 and 1056. δH (400 MHz, CDCl3) 1.44 (3 H, d, J = 6.0 Hz, CH3CHOCO), 2.19 (3 H, s, CH3CO2), 2.52 (3
H, s, SCH3), 3.44 (1 H, dd, J = 1.2 and 5.2 Hz; CHCHO), 5.38 (1 H, quintet, J = 6.0 Hz, CH3CHO), 6.18 (1 H, d, J =
16.0 Hz; CH=CHCO), 6.23 (1 H, d, J = 1.2 Hz; 1H, CHOAc), 6.87 (1 H, d, J = 8.0 Hz, arom), 6.97 (1 H, dd, J = 2.0
and 8.4 Hz; arom), 7.06 (1 H, d, J = 1.6 Hz; arom), 7.54 (1 H, d, J = 16.0 Hz; CH=CHCO). δC (50 MHz, CDCl3)
18.2, 20.9, 22.7, 63.8, 65.9, 80.8, 114.1, 114.3, 115.4, 122.4, 126.9, 144.2, 146.1, 147.0, 166.5, 168.5, 170.1.
HPLC-MS (ESI): Rt = 5.6 min, m/z: 399 [M + H2O] +, 404 [M + Na]+, 785 [2M + Na]+.
Methyl 4-(ethoxymethoxy)-3,5-dimethoxybenzoate (43):
A solution of methyl 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoate (1.24 g, 5.9 mmol) in
THF (10 mL) was added dropwise to a suspension of NaH (60% in mineral oil,
306 mg, 7.6 mmol) in THF (20 mL) at 0 °C under inert atmosphere. After 10
minutes a solution of chloromethylethylether (1.1 mL, 11.75 mmol) in THF (7
mL) was added dropwise and the reaction was allowed to warm to room
temperature and monitored by TLC. After 2 h the reaction was quenched with aqueous NH4Cl (30 mL) and extracted with EtOAc (3 x 20 mL). The organic extracts were dried over Na2SO4
and concentrated to obtain product 43 (1.46 g, 92%) as pale yellow solid. Found C, 57.62; H, 6.80 %; C13H18O6
requires C, 57.77; H, 6.71 %; mp: 52.7-55.6 . νmax/cm -1 2926, 1720, 1592 and 1128. δH (200 MHz, CDCl3) 1.21 (3 H, t, J = 7.0 Hz, CH3CH2), 3.88 (2 H, q, J = 7.0 Hz, CH3CH2), 3.90 (6 H, s, 2 x OCH3), 3.92 (3 H, s, CO2CH3), 5.23
(2 H, s, OCH2O), 7.31 (2 H, s, arom). δC (100 MHz, CDCl3) 14.6, 51.8, 55.8, 64.6, 96.2, 106.4, 125.3, 138.4,
152.8, 166.3. HPLC-MS (ESI): Rt = 7.81 min, m/z: 271 [M + H] +, 293 [M + Na]+, 309 [M + K]+.
Methyl 4-(ethoxymethoxy)-3,5-dimethoxy benzoic acid (44):
A stirred solution of 43 (730 mg, 2.7 mmol) in 10 mL of a mixture of
THF/MeOH: 90/10 was treatd with 5 M NaOH (2.7 mL). The reaction was
heated at 40° C for 4 hours and monitored by TLC. At completion, EtOAc (10
mL) was added and the organic phase was separated and discarded. The
aqueous phase was then cooled to 0° C and adjusted to pH 6 with aqueous
NH4Cl. The mixture was extracted with EtOAc (3 x 15 mL), dried on Na2SO4 and concentrated to afford 44 (432 mg, 63%) as a white solid. Found C, 56.18; H, 6.34 %; C12H16O6 requires C,
56.24; H, 6.29 %; mp: 107.7-109.4 °C. νmax/cm -1 3398, 2924, 1716, 1589 and 1120. δH (400 MHz, CDCl3) 1.22 (3 H, t, J = 7.2 Hz, CH3CH2), 3.89 (2 H, q, J = 7.2 Hz, CH3CH2), 3.92 (6 H, s, 2 x OCH3), 5.26 (2 H, s, OCH2O), 7.37
(2 H, s, arom). δC (75 MHz, CDCl3) 14.8, 56.0, 64.9, 96.3, 107.1, 124.5, 139.3, 153.0, 171.5. HPLC-MS (ESI): Rt =
1.53 min, m/z: 279 [M + Na] +, 535 [2M + Na]+.
(E)-methyl 3-(3,4-bis(ethoxymethoxy)phenyl)acrylate (45): A solution of caffeic acid methyl ester [37] (540 mg, 2.78 mmol) in THF
(6 mL) was added dropwise into a solution of NaH (60% dispersion in oil,
289 mg, 7.2 mmol) in THF (15 mL) under inert atmosphere and at 0°C.
After 10 minutes a solution of chloromethyl ethyl ether (1.01 mL, 11.1 N O O SMe OAc O HO HO O O O MeO OMe O OH O O MeO OMe O O O O O O O mmol) in THF (7 mL) was added dropwise. After 2 h the solution was allowed to rt and quenched by adding a
saturated NH4Cl solution, extracted with CH2Cl2, dried over Na2SO4 and evaporated. The product 45 was
obtained in 90% yield (776 mg) after flash-cromatography (cyclohexane/etylacetate 90/10) as a colorless oil.
Found C, 62.12; H, 7.38 %; C16H22O6 requires C, 61.92; H, 7.15 %; νmax/cm -1 2977, 2900, 1717, 1634, 1600, 1582, 1511, 1436, 1393, and 1105. δH (400 MHz, CDCl3) 1.21-1.27 (6 H, m, 2 x OCH2CH3), 3.74-3.81 (4 H m, 2 x
OCH2CH3), 3.81 (3 H, s, OCH3), 5.30 (1 H, s, OCH2O), 5.31 (1 H, s, OCH2O), 6.33 (1 H, d, J = 16.0 Hz, CH=CHCO),
7.15 (1 H, dd, J = 2.0 and 8.0 Hz; arom), 7.19 (1H, d, J = 8.4 Hz, arom), 7.39 (1 H d, J = 1.6 Hz; arom), 7.63 (1 H,
d, J = 16.0 Hz, CH=CHCO). δC (50 MHz, CDCl3) δ 14.9, 15.0, 51.4, 64.3, 64.4, 93.6, 94.0, 115.5, 115.9, 116.0,
123.1, 128.5, 144.4, 147.4, 149.2, 167.4. HPLC-MS (ESI): Rt = 9.2 min, m/z: 311 [M + H] +, 333 [M + Na]+, 349 [M + K] +.
(E)-3-(3,4-bis(ethoxymethoxy)phenyl)acrylic acid (46): A stirred solution of 45 (310 mg, 1 mmol) in 3.8 mL of a mixture of
THF/MeOH 90/10 was treated with 1 mL NaOH 5M, warmed at 40°C and
stirred for 4 h. After completion, AcOEt (6 mL). was added and
discharged. The acqueous phase was treated with HCl (1M), extracted
with AcOEt, the organic phase was dried over Na2SO4 and evaporated to afford the desired product in 96% yield (284 mg) as a white solid. Found C, 60.52; H, 6.95 %; C15H20O6
requires C, 60.80; H, 6.80 %; mp: 101-103 °C. νmax/cm -1 2976, 1683, 1626, 1596, 1514, 1418, 1244 and 1114. δH (400 MHz, CDCl3) δ 1.22-1.29 (6 H, m, 2 x OCH2CH3), 3.75-3.85 (4 H, m, 2 x CH3CH2O), 5.31 (1 H, s, OCH2O),
5.33 (1 H, s, OCH2O), 6.35 (1 H, d, J = 16.0 Hz; CH=CHCO), 7.18 (1 H, dd, J = 1.6 and 8.8 Hz; 1H, arom), 7.22 (1
H, d, J = 8.8 Hz, arom), 7.42 (1 H, d, J = 1.6 Hz, arom), 7.73 (1 H, d, J = 16.0 Hz, CH=CHCO). δC (50 MHz, CDCl3)
15.0, 15.1, 64.5, 64.6, 93.8, 94.2, 115.5, 115.8, 116.0, 123.7, 128.3, 146.8, 147.5, 149.7, 172.1. HPLC-MS
(ESI): Rt = 1.90 min, m/z: 297 [M + Na] +, 319 [2M + Na]+, 335 [M+K]+.
3,4-bis((tert-butyldimethylsilyl)oxy)benzoic acid (47):
To a solution of 3,4-dihydroxy-benzoic acid (500 mg, 3.24 mmol) in DMF (5.8 mL) under inert atmosphere, imidazole (1.983 g, 29.16 mmol) and then TBSCl (2.200 g, 14.6 mmol) were added.
After 66 h the reaction was quenched at 0°C by adding water, and then extracted
with Et2O (10 x 4 mL). The organic phases were washed twice with water and brine,
dried over Na2SO4 and evaporated. To the persilylated intermediate (2.049 g, 4.12
mmol) in a 6 mL MeOH/THF 40/60, a solution of K2CO3 (231 mg, 1.67 mmol) in
water (2.2 mL) was added. After 12 h the mixture was quenched a 0°C by adding a saturated solution of citric acid and extracted with Et2O. The organic phases were washed with water and
brine, dried over Na2SO4 and evaporated. The product was finally obtained by flash-cromatography
(CH2Cl2/MeCN: 90/10) in 75% yield (930 mg) as a white solid (found C, 59.64; H, 8.96 %. C19H34OSi2 requires
C, 60.80; H, 6.80 %); mp: 152-154 °C; δH (400 MHz, CDCl3) δ 0.24 (6 H, s, SitBuMe2), 0.25 (6 H, s, SitBuMe2),
1.00 (9 H, s, SitBuMe2), 1.01 (9 H, s, SitBuMe2), 6.88 (1 H, d, J = 8.0 Hz, arom); 7.60 (1 H, d, J = 2.0 Hz, arom),
7.63 (1 H, dd, J = 1.6 and 8.8 Hz; 1H, arom); δC (50 MHz, CDCl3) -4.1, -4.0, 18.4, 18.5, 25.8, 25.9, 120.5, 122.4,
122.7, 124.4, 146.8, 152.5, 171.2.

Metodologie di determinazione della attività antiossidante
Saggio BR
Relative antioxidant activity (r.a.c.) with respect to a substance chosen as standard, resorcinol (Re) in our
case, is determined on the basis of concentrations of sample and resorcinol that give the same tinhib; r.a.c. is
expressed as μM resorcinol equivalents [18]. Oscillatory behaviours V(Pt) were followed potentiometrically
by using the couple bright platinum electrode (Hamilton 238 945) '' Ag/AgCl double junction electrode
(Ingold 373-90-WTE-ISE-S7) connected to a multimeter (WTW pH 540 GLP), controlled by a PC. Reacting
mixtures were thermostated at 25.0 ± 0.1 °C. The straight line of the standard was checked before each
series of measurements.
More details on the experimental procedure are reported in refs. [18, 19, 34].

Saggio TEAC
The radical cation is preformed by reaction between ABTS and K2S2O8 in PBS medium, pH = 7.4. The mixture
was kept in the dark until the reaction was complete and absorbance at 734 nm stable. Spectroscopic
measurements were performed in triplicate at four concentration of the β-lactams in DMSO. Suitably diluted
solutions of the standard (Trolox) were treated in the same way. In brief, 3.0 mL of diluted ABTS '+ solution and 30 µL of sample were mixed in a photometric cuvette and absorbance was measured at 734 nm at OH O O O O O OH O TBSO TBSO exactly 6 min after the mixing of the reagents (T = 30.0 ± 0.1 °C). A blank with DMSO was measured in the
same way. The difference between the absorbance of the blank and the sample gave 'E6 (E6blank-E6sample
= 'E6). Data ('E6 vs conc (mM)) are well fitted by straight lines through the origin (following the Lambert-
Beer law). Then, the relative antioxidant activity with respect to Trolox (TEAC) was obtained by the ratio:
TEAC = m(smp)/m(Trolox)
where m(smp) and m(Trolox) are the slopes of the straight lines of the sample and the standard respectively.
Standard error of this ratio is calculated in the usual way.
Here also the straight line of the standard was always checked before each series of measurements.

Saggio DPPH
The principle of this method is the decolorization of the stable radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH ') by antioxidants [21, 22]. The DPPH ' is intensely purple colored (λ max = 512-530 nm) due to the presence of the picric group (1,3,5-nitrobenzene) and is stabilized by either the steric hindrance of the aromatic
substituents and the delocalization of the unpaired electron on the whole structure. The disappearance of
this radical due to the addition of an antioxidant H-donor, may be evaluated spectrophotometrically, at its
absorption maximum in methanol (515 nm). The measured decrease in absorbance at 515 nm is an
expression of the antioxidant capacity of a sample [35]. The extent of the decolorization is a function of
concentration and time. Trolox was used as the standard. In practice 2.900 mL of DPPH' methanolic solution
were placed in a cuvette and the initial absorbance, A0, was measured. Then 100 mL were added and mixed;
after 15 minutes the final absorbance, Af, was measured. The percentage of inhibition was calculated
according to the following equation (%) Inhibition = (1-Af/A0) ' 100. The same procedure was repeated with
the standard. Data (%inhib vs conc (mM)) are well fitted by straight lines through the origin (following the
Lambert-Beer law). Then, the relative antioxidant activity with respect to Trolox was obtained by the ratio:
DPPH = m(smp)/m(Trolox).

Saggio FRAP
2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine-Fe 3+ (FRAP reagent) was prepared by mixing suitable amounts of TPTZ and FeCl3 solutions in aqueous acetate buffer. In brief, 3.0 mL of FRAP reagent and 100 µL of suitably diluted
sample were mixed in a photometric cuvette and absorbance was measured after exactly 4 min after the
mixing (T = 25.0 ± 0.1°). The absorbance of the blue Fe 2+ complex is measured at 593 nm (Shimadzu UV-1601 PC spectrophotometer). Four or five different sample concentration were tested and the straight line Abs vs.
conc. was then compared with that of the standard (FeSO4). The Lambert-Beer law is followed, then the
ratio: FRAP = m(smp)/m(Fe 2+) gives the relative ferric reducing activity (mmol equiv. Fe2+).
Voltammetria Ciclica
All electrochemical experiments were conducted in Acetonitrile from Sigma-Aldrich (> 99.5% over molecular
sieves) after careful dearation of the reaction mixture with argon; in all instances a silver wire was used as a
pseudo-reference electrode, while a platinum coil was used as a counter electrode. Voltammetric analysis
was performed with platinum, gold and glassy carbon working electrodes ('=2mm) using a function
generator AMEL mod 568 equipped with a digital oscilloscope.

Attività Biologica
Bacterial isolates
A collection of 45 recently isolated and well characterized for the antimicrobial susceptibility phenotype
MRSA strains recovered from CF patients was tested. All the strains were isolated at the Department of
Pediatrics, CF Center, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico, University of Milano

Determinazione della suscibilità antibatterica
The in vitro susceptibility of methicillin-resistant isolates of S. aureus to new antimicrobial compounds was
evaluated by means of the broth microdilution method for the determination of the minimum inhibitory
concentrations (MIC), in accordance with the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; formerly
National Committee for Clinical Laboratory Standards) guidelines [38].
Briefly, serial two-fold dilutions were made of the compounds in 96-well plates in order to obtain
concentrations ranging from of 0.06''128 mg/L in cation-adjusted Muller-Hinton broth ( DIFCO). An equal
volume of 1 x 10 6 CFU/mL (Colony Forming Unit/mL) bacterial inoculum was added to each well of the microtitre plate containing 0.05 mL of the serial antibiotic concentrations. The microtitre plate was then
incubated overnight at 37°C and subsequently analysed for the presence of visible bacterial growth. MIC was
defined as the lowest concentration of the tested compound able to inhibit visible growth of the microorganism after overnight incubation. All the tested compounds were solubilized in 100% DMSO and
appropriate dilutions were set up to prevent its toxicity. Positive strain controls without antimicrobial
compounds, controls with DMSO and uninoculated media were run parallel to the tested compounds under
the same conditions.
Staphylococcus aureus American Type Culture Collection (ATCC) 29213 (MSSA) and ATCC 43300 (MRSA) were
used as control strains. Cefotaxime sodium salt was used as the reference antibiotic for MIC experiments
validation. Breakpoints for resistance were those recommended by the CLSI [39].


Parte sperimentale relativa al capitolo 1.2.3.
I β lattami
Monocyclic -lactams P1 and P2 were prepared according to procedures previously reported (Galletti et al.,
2011) and summarized in Scheme 1. P1 was prepared from the commercial 4-acetoxy-azetidinone with
lithium hexamethyldisilylamide (LiHMDSA) and S-methyl-methanethiosulfonate in THF. P2 was prepared
from (3R,4R)-4-acetoxy-3-[(1R)-1-(tert-butyldimethylsilyloxy)-ethyl]-azetidin-2-one and S-methyl- methanethiosulfonate; in this case the N-thiomethylation was more efficiently conducted using NEt3 as the
base in CH2Cl2 instead of LiHMDSA.
A stock solution of synthesized antibiotics P1 and P2, with an estimated purity of 99%, were prepared
dissolving known amount of each drug (both of dense oily appearance) in 5 mL ethyl acetate (RPE ACS grade,
Carlo Erba). Amoxicillin trihydrate of 97% purity was furnished by Gellini International srl (Italy). A stock
solution at the maximal solubility (1.3 mM) was prepared dissolving amoxicillin trihydrate powder in
methanol. Known volumes of antibiotic stock solution were withdrawn and the solvent removed by
evaporation. Then each antibiotic was dissolved in water (Millipore Ultra gradient) for hydrolysis
experiments, or added with soils for soil degradation trials.

Terreni
Two soils from northern Italy (Bologna area) were selected for this study: soil 1 (S1) and 2 (S2). After
collection of the soil first centimetres, the samples were air dried, sieved at < 2 mm, and stored at room
temperature (RT) in the dark. Selected physical and chemical properties of the soils were measured. Soil pH
was determined in water or 0.01 M CaCl2 aqueous solution with a soil:solution ratio of 1:2.5 w/w. CaCO3
content was evaluated by the Dietrich-Freuling calcimeter (Loeppert and Suarez, 1996). Particle size
distributions were performed using the hydrometer method (Sheldrick and Wang, 1993). Water content of
soils at wilting point (-15 bar) and at field capacity (-15 and -0.33 bar of suction pressure) were determined
according to the gravimetric method at 105°C for 24 h. Total organic carbon content (TOC) was determined
by CHN analyzer (Model EA 1110 CHNS-O, CE Instruments, UK).
Experiments conducted in soils under reduced microbial activity were performed by autoclaving the soils as
reported by Alef (1995) and Trevors (1996) treating small portions of soils: shortly, before use, 50 g of soil
were spread out in thin layer (1''2 cm) inside a glass flask, then autoclaved at 121°C and 1.1 atm for 1 h.

Cinetica di idrolisi a diversi pH
Antibiotic solutions were prepared in buffered media at pH 3 and 5 (20 mM trisodium citrate, Carlo Erba),
and pH 7 and 9 (20 mM, dibasic potassium phosphate, Fluka). Sodium azide (0.1%, Carlo Erba) was finally
added to the buffered solution in order to ensure the sterility of aqueous media. Buffered solutions, at the
antibiotic concentrations of 100 M for product P1 and 30 M for product P2, were kept in the dark at 25 ±
2°C on a horizontal shaker for the entire duration of the trials. The low concentration for P2 was due to its
low solubility and resulted about 35 M at RT as determined by HPLC. At specific times, aliquots of buffered
antibiotic solutions were withdrawn and directly analyzed in HPLC. The experiments were run in triplicate.
Buffered solutions at pH 3, 5, 7, and 9 of amoxicillin (100 M) were prepared for comparison.

Cinetica di degradazione nei terreni
Experiments of antibiotic degradation in soils S1 and S2 (both untreated and autoclaved) at RT were
performed at wilting point and at field capacity. Also experiments with soils alone were run as control. All
experiments were run in triplicate.

Punto di Wilting
Experiments at the wilting point were set preparing a number of trials where 5 L of P1 or P2 stock solutions
were placed in polyallomer centrifuge tubes (Nalgene ®) and, after removal of the solvent by evaporation, added with 2.5 g of soil S1 or S2 both at the wilting point (2.3% and 1.5% soil dry weight - DW - vide infra
Table 2). The final concentrations for P1 and P2 were 0.5 and 0.14 mmol kg -1 soil DW, respectively. To follow the degradation in soils at wilting point, at specific time intervals, suitable milliQ water volumes
were added to centrifuge tubes in order to reach the final value of 5 mL (4.942 mL in S1 and 4.962 mL in S2)
and kept on a horizontal shaker for 15 min. The supernatants were then separated from soil particles by two
centrifugation cycles at 15000 g for 15 min each, and directly analyzed by HPLC. To desorb any chemicals
possibly adsorbed on soil solid phases, each pellet was shaken for 15 min with a mixture of acetonitrile and
methanol 50%:50% v:v (4.3 and 4.085 mL for S1 and S2, respectively, to reach a final volume of 5 mL). The
antibiotics amounts in the residual water after centrifugation were then subtracted from the measured
concentration. Each trial was used to give one concentration point: after analysis, the extracted soil and
supernatant were discarded. The same trials were conducted in soils under reduced microbial activity (soils
autoclaved as reported above). The persistence of amoxicillin in untreated and autoclaved soils at the
concentration of 0.2 mmol kg -1 soil DW was also performed at wilting point as comparison test.
Field Capacity
Experiments at field capacity were set placing in polyallomer centrifuge tubes (Nalgene ®) 5 L of P1 or P2 stock solutions and, after removal of the solvent by evaporation, adding with 2.5 g of dry soil S1 and S2 both
brought at the field capacity (28.0% and 36.6% soil dry weight - DW '' vide infra Table 2). The final
concentration for P1 and P2 was 0.5 and 0.14 mmol kg -1 soil DW, respectively. At specific times, soils were extracted with suitable milliQ water volumes added to centrifuge tubes in order
to reach the final value of 5 mL (4.300 mL in S1 and 4.085 mL in S2) and kept on a horizontal shaker for 15
min. After that, soils were extracted and processed in the same way as described for the wilting point
condition. The same experiments were conducted in soils under reduced microbial activity (autoclaved as
reported above). The persistence of amoxicillin in untreated and autoclaved soils at the concentration of 0.2
mmol kg -1 soil DW was also performed as comparison.
Analisi Cromatografiche
HPLC-DAD
The concentration of P1 and P2 and of their degradation products was determined by high performance
liquid chromatography (HPLC). The system was assembled with a Jasco 880-PU Intelligent pump, a Jasco AS-
2055 plus Intelligent sampler, a Jasco 875-UV Intelligent UV-vis detector at 195 nm, a Jones Chromatography
model 7971 column heater set at 35°C, and a Borwin Chromatography Software.
For P1 the analytical column was a Synergi 4 u Hydro '' RP 80A (150x4.60 mm) eluted with 10% acetonitrile
(HPLC grade, J.T.Baker) and 90% milliQ water at 1 ml min -1. Under these chromatographic conditions P1 retention time was 12.9 min.
P2 was monitored with a Kinetex 2.6u PFP 100A (100x4.60 mm) analytical column eluted with 55%
acetonitrile and 45% milliQ water at 0.3 ml min -1 with 7.20 min retention time. P2 transformation products were followed applying P1 analytical set up. The different analytical conditions applied to P2 compared to its
degradation products was mainly due to the tert-butyldimethyl silyl group contained in the P1 structure (but
not in its degradation products) that renders P1 extremely hydrophobic (CLog Kow = 3.8789, Scheme 1).
The UV spectra of P1 and P2 (not reported for brevity) were characterized by an intense absorption at
wavelength lower than 195 nm and a weak absorption at 241 and 237 nm, respectively. The absorption was
even weaker at wavelength longer than 300 nm. Though the maximal absorption was not centred at 195 nm,
the HPLC UV detector was set at this value for both antibiotics due to the low intensity of the signal in the
range 241-237 nm. In addition, product P2 is scarcely soluble in water (ca. 35 M at RT) owing to its high
value of CLogKow (3.8789, Scheme 1) and its signal at 237 nm resulted undetectable in a complex matrix
such as soil.
Amoxicillin was quantified at 274 nm with a Waters Spherisorb 5m C8 (250x4.6 mm) analytical column
eluted with 90% milliQ water (pH 5 by formic acid, Riedel-de Haën) and 10% methanol (HPLC grade,
J.T.Baker) at 1 ml min -1. Amoxicillin retention time under these conditions was 4.7 min. The quantitative determination of products P1, P2, and amoxicillin was performed measuring the average
value of triplicate injections and was performed by using external standards (rworking line = 0.999, 0.994, 0.999
for product P1, product P2 and amoxicillin, respectively). Calculations were based on the average peak areas
of the external standards.
The P1 hydrolysis at alkaline pH gave rise to a number of primary byproducts named P1-1, P1-2, P1-3, and
P1-4, whose retention times were 3.2, 1.7, 2.6, and 2.1 min and whose maximal adsorption wavelengths
(max) were 239, 255, 262 and 327 nm, respectively. Product P2 in water at acidic pH values gave a single UV-
visible byproduct, monitored by Kinetex and related elution conditions, named P2-1 (8.1 min retention time,  max < 195 nm) along with three additional products, monitored by Synergi analytical column and related elution conditions, which are named P2-2 (max 263, 3.30 min retention time), P2-3 (max 240, 3.65 min
retention time), and P2-4 (max 255, 3.10 min retention time).

LC-ESI-MS single quadrupole
The LC-MS equipment was assembled as follows: HPLC Agilent Technologies 1100 series, DAD detector (UV
lengths 210 nm and 254 nm), Phenomenex Gemini C18 column '' 150x4.6 mm 3 i.d., flow 0.4 ml min -1; elution conditions: H2O/CH3CN from 70/30 to 20/80 in 8 min; Agilent Technologies MS single quadrupole
1100 series mod. G 1946B, drying gas flow: 10.5 l min -1, nebulizer pressure 25 psgi, drying gas temperature 350°C, capillary voltage 4500 positive scan, scan range: 100-2600 uma. The LC-ESI-MS analysis performed in
positive scan gave the following m/z (%): 133 (100) [M-H2O] + for P1-2 and 461 (50) [2M+Na]+, 242 (100) [M+Na] +, 220 (15) [M+H]+ for P2-1. The [M-H2O]+ mass signal has been already reported to form under similar ionization conditions adopted for other -lactams whose structures are very similar to P1-2.

LC-ESI-MS ion trap
The LC-MS equipment was assembled as follows: Agilent Technologies 1100 series HPLC, DAD detector (UV
wavelength 210 and 254 nm), Agilent Technologies Eclipse XDB-C18 column - 150x4.6 mm 3 i.d., flow 0.4 ml
min -1; elution conditions: H2O/CH3CN from 70/30 to 20/80 in 8 min; Agilent Technologies MS Ion Trap 1100 series mod. G 2445D, drying gas flow: 11.0 l min -1, nebulizer pressure: 25 psgi, drying gas temperature 300°C, capillary voltage 4500 in positive scan and 4000 in negative scan, scan 50-2200 uma. The LC-ESI-MS ion trap
analysis performed in negative scan gave the following m/z (%): 246 (100) [M+2H2O+OH] - for P1-1 and 182 (100) [M+H2O+OH] - for P1-3, 311 (90) [2M+H2O+NaCO3]-, 293 (100) [2M+NaCO3]- for P1-4.
Analisi dei dati
Hydrolysis and, when possible, soil degradation kinetics data were processed according to first order rate
law, ln C/C0 = - kobs t, where C is the antibiotic concentration (in M units) at t time, C0 is the initial antibiotic
concentration, and kobs is the first order rate degradation constant.

Parte Sperimentale relativa al paragrafo 1.3.1
Chimica: Parte Strumentale
All reactions were performed under an inert atmosphere (N2). Commercial reagents (reagent grade, >99%)
were used as received without additional purification. Anhydrous solvents (CH3CN, CH2Cl2, THF, ) were
obtained commercially. 1H and 13C NMR values were recorded on a INOVA 400, or a GEMINI 200 instrument with a 5 mm probe. All chemical shifts have been quoted relative to deuterated solvent signals, in ppm and
J in Hz. FT-IR: Nicolet 380 measured as films between NaCl, plates wavenumbers reported in cm-1. TLC:
Merck 60 F254. Column chromatography: Merck silica gel 200-300 mesh. GC-MS: Agilent Technologies,
column HP5 5% Ph-Me Silicon MS: Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, EI
voltage 70 eV, gradient from 50 °C to 280 °C in 30 min. HPLC-MS, HPLC: Agilent Technologies H29100,
column ZOBRAX-Eclipse XDB-C8 Agilent Technologies, mobile phase: H2O/CH3CN, gradient from 30% to 80%
of CH3CN in 8 min, 80% of CH3CN until 25 min, 0.4 mL/min MS: Agilent Technologies MSD1100 single-
quadrupole mass spectrometer, full-scan mode from m/z 50 to m/z 2600, scan time 0.1 s in positive ion
mode, ESI spray voltage 4500 V, nitrogen gas 35 psi, drying gas flow 11.5 mL/min, fragmentor voltage 20 V.
Elemental analysis were performed on a Thermo Flash 2000 CHNS/O Analyzer. A Shimadzu UV-1601 PC
spectrophotometer was used for spectrophotometric measurements.

Chimica: Sintesi
(Z
)-2-(4-oxoazetidin-2-ylidene)acetic acid (48). To a solution of 48 (220 mg, 1.01 mmol) in a 10 mL mixture of THF/Methanol 1:1 was
added Pd 10% wt on activated Carbon (44 mg). The solution was treated with H2 (1
atm) and after 2 h was filtered on celite and concentrated to give 48 (100 mg, 78%).
Yellow solid: mp = 162-163; 1H NMR (400 MHz, (DMSO d6): δ=3.57 (s, 2H), 4.98 (s, 1H), 10.47 (brs, 1H), 11.94 (brs, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ=46.0, 92.2, 153.3, 169.7, 171.0 ppm; IR (neat): 3289, 2919, 1828, 1185; HPLC-MS (ESI): Rt=min 1.66, m/z (%): 128 [M+H] +, 150 [M+Na] +, 679 (70) [2M+Na]+ ; Found C, 47.20; H, 3.88; N, 11.04 %; C5H5NO3 requires C, 47.25; H, 3.97; N, 11.02%.

NH O COOH (E)-3-hydroxy-3-methyl-5-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)pent-4-enenitrile (49); To a stirred solution of acetonitrile (330 µL, 6.24 mmol) in dry THF (5 mL) at -78° C
under inert atmosphere were added dropwise nButyllithium 2.5 M in THF (6.86 mmol,
2.74 mL) and thereupon a solution of β-ionone (1 g, 5.2 mmol) in dry THF (4 mL) were
added over a period of 10 minutes. The solution was allowed to warm at room
temperature and after 3 h the reaction was quenched with aqueous NH4Cl (10 mL) and extracted with EtOAc(3x10 mL).The organic extracts were dried over Na2SO4, filtered and concentrated in
vacuo. Flash chromatography (cyclohexane/EtOAc: 80/20) of the extracts gave 49 (1.031 g, 85%).
Pale yellow oil: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.92 (s, 6 H, C(CH3)2), 1.35-1.38 (m, 2 H, C(CH3)2CH2CH2CH2), 1.41 (s, 3 H, CH3C(OH)), 1.49-1.55 (m, 2 H, C(CH3)2CH2CH2CH2), 1.58 (s, 3 H, CH3C=C), 1.88-1.91 (m, 2 H,
C(CH3)2CH2CH2CH2), 2.56 (s, 2 H, CH2CN), 3.34 (brs, 1 H, OH), 5.45 (d, 1 H, J = 16.0 Hz, CH=CHC(OH), 6.11 (d, 1
H, J = 16.0 Hz, CH=CHC(OH)) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 18.8, 20.9, 27.4, 28.3 (2 x C), 31.6, 32.3, 33.6, 38.9, 70.8, 117.3, 127.1, 128.5, 136.0, 136.6 ppm; IR (neat); ν = 3444, 3023, 2925, 2256, 1722, 1651,
1644, 1114 cm -1; GC-MS (EI): Rt = 16.81 min, m/z: 233 [M]+, 218 [M '' CH3]+, 193 [M '' CH2CN]+, 135, 109, 91, 69;Found C, 77.11; H, 9.90; N, 6.08 %; C15H23NO requires C, 77.21; H, 9.93; N, 6.00%.

(2ZE,4E)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)penta-2,4-dienenitrile (50EZ)
A solution of 49 (400 mg, 1.72 mmol) and pToluensulfonic acid (33 mg, 0.172 mmol) in toluene (17 mL) was refluxed and the reaction was followed by TLC. After the completion of the
reaction the solution was cooled at 0° C and washed with a solution of NaHCO3
5% and after with water. The organic extracts were dried over Na2SO4, filtered
and concentrated in vacuo obtaining 352 mg (95%) of 50 as a E/Z : 54/46mixture.
Characterization resulted in agreement with the reported data [16].
(2EZ,4E)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)penta-2,4-dien-1-amine (51EZ): Orange oil: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.01 (s, 6 H, C(CH3)2, trans ), 1.02 (s, 6 H, C(CH3)2, cis ) 1.42-1.58 (m, 2 H, CH2CH2C(CH3)2), 1.58-1.65 (m, 2 H,
CH2CH2C(CH3)2), 1.68 (s, 3 H, CH2CH2C(CH3)=C, trans), 1.71 (s, 3 H,
CH2CH2C(CH3)=C, cis), 1.81 (s, 3 H, CH3C=CH, trans), 1.88 (s, 3 H, CH3C=CH, cis),
1.98-2.01 (m, 2 H, CH2CH2C(CH3)=C), 2.09-2.40 (bs, 2H, NH2), 4.06 (d, 2 H, J =6.8 Hz, CH2NH2), 5.42 (dd, 1 H, J = 6.4, 7.6 Hz, C=CHCH2NH2, cis), 5.50 (dd, 1 H, J = 6.4 Hz, 7.2 Hz, C=CHCH2NH2,
trans), 5.98-6.09 (m, 2H, CH=CH, trans), 6.14 (d, 1 H, J = 15.6 Hz, CH=CH, cis), 6.36 (d, 1 H, J = 15.6 Hz, CH=CH,
cis) ppm; 13C (50 MHz, CDCl3): 12.3, 19.2, 21.5, 28.8 (2 x C), 32.8, 34.1, 38.7, 39.5, 125.8, 128.3, 128.5 (cis), 129.0 (cis), 129.5, 129.7 (cis), 131.3, 133.4 (cis), 134.5 (cis), 137.3, 137.6, 137.9 (cis) ppm; IR (neat); ν = 3373,
2928, 2866, 1454, 1266 cm -1; GC-MS (EI): Rt = 16.09 (cis), 16.57 (trans) min, m/z: 219 [M]+, 204 [M '' CH3]+, 187 [M '' CH2CN] +, 162, 131, 119, 91, 83.
(2Z)-N-((2EZ,4E)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)penta-2,4-dienyl)-2-(4-oxoazetidin-2-
ylidene)acetamide (52EZ).
To a solution of β-lactam 48 (55 mg, 0.43 mmol) in dry DCM (4.5 mL) under inert atmosphere at 0° C were
added amine 52EZ (94 mg, 0.43 mmol), DMAP (53 mg, 0.43 mmol) and after 10 minutes EDCI (82.5 mg, 0.43
mmol). The solution was stirred at 0° C for 45 minutes and after was allowed to warm at room temperature.
The reaction was followed by TLC and after the disappearing of the starting materials was quenched with aqueous NH4Cl (10 mL) and extracted with DCM (3x5 mL). The
organic extracts were dried over Na2SO4, filtered and
concentrated in vacuo. The E/Z mixture was separated by flash
chromatography (cyclohexane/EtOAc 70/30) affording 2 (62
mg) and 8 (44 mg) in a overall yield of 75%. Configurations of
the two diastereoisomers was assigned by NOE 1D studies. 52E: orange syrup: Rf=0.4 (cyclohexane/EtOAc, 5/5); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.00 (s, 6H), 1.46 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.68 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 2.01 (m, 2H), 3.51 (s, 2H), 4.06 (m, 2H), 5.02 (s, 1H), 5.30 (brs, 1H, NH),
5.43 (m, 1H), 6.01 (d, J=16 MHz, 1H), 6.13 (d, J=16 MHz, 1H), 8.75 (brs, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ=12.5, 19.2, 21.6, 28.8, 29.7, 32.9, 34.2, 37.3, 39.5, 44.9, 92.2, 124.9, 127.0, 129.0, 136.6, 137.5, 137.6,
146.6, 165.3, 166.3 ppm; IR (neat): ṽ=3367, 3250, 2958, 2922, 2853, 1815, 1692 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=min 12.72, m/z (%): 329 [M+H] +; Found C, 73.09; H, 8.63; N, 8.59 %; C20H22N2O2 requires C, 73.14; H, 8.59; N, 8.53%.

OH CN CN NH2 NH O O H N 52Z: orange syrup: Rf=0.5 (cyclohexane/EtOAc, 5/5); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.26 (s, 6H), 1.47 (m, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.70 (s, 3H), 1.91 (s,
3H), 2.02 (m, 2H), 3.51 (m, 2H), 4.04 (m, 2H), 4.99 (s, 1H), 5.25 (brs, 1H,
NH), 5.36 (m, 1H), 6.22 (d, J=16 MHz, 1H), 6.38 (d, J=16 MHz, 1H), 8.72
(brs, 1H, NH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ=19.2, 20.3, 21.7, 28.9, 29.7, 32.9, 34.1, 36.4, 39.5, 44.9, 92.3, 123.1, 129.0, 129.6, 129.7, 136.7,
137.7, 146.4, 165.3, 166.3 ppm; IR (neat): ṽ=3327, 2954, 2923, 2853,
1810, 1683 cm -1; HPLC-MS (ESI): Rt=min 11.21, m/z (%): 329 (65) [M+H]+, 351 (100) [M+Na] +, 679 (70) [2M+Na]+; Found C, 73.07; H, 8.65; N, 8.57 %; C20H22N2O2 requires C, 73.14; H, 8.59; N, 8.53%.

Biologia: Culture cellulari e trattamenti
Human neuroblastoma SH-SY5Y cell line were cultured in DMEM/F12 (Gibco-Invitrogen, Milan, Italy)
supplemented with 10% fetal bovine serum ( Euroclone, Milan, Italy), 1X MEM/NEAA (Gibco-Invitrogen), 1X
Penicillin-Streptomycin (Gibco-Invitrogen) and NaOH 10 mM (Carlo Erba) and maintained at 37°C in a
humidified 5% CO2 incubator.
b-Lactams MP171, 2, and all-trans retinoic acid (RA, Sigma Aldrich) were dissolved in dimethylsulfoxide
(DMSO, Sigma Aldrich) to an intermediate concentration of 100 mM (MP171 and 2), and 16.6 mM (RA). Final
dilutions (10 microM for compound 2 and RA, 7.5 microM for compound MP171) were done in the culture
medium. A corresponding volume of DMSO was added to control cells (vehicle treated). To evaluate
citotoxic effect exerted by MP171 and 2 on SH-SY5Y cells were seeded at a density of 1x10 4 cells/well in 96 platic multiwells/dish; 24 hrs after seeding were treated for 24 hrs with compounds 1 and 2 in the
concentration range 1 microM-1 mM and MTT assay was performed [33]. Cytotoxicity of compounds 1 and
2 on SHSY5Y (IC50) was assessed in order to define the working concentration (IC501= 10-28 microM
R 2=0.973; IC502=38-65 R2=9,988)
Effetti di Proliferazione di MP171
To evaluate the effect of MP171 on proliferation, cells were seeded at a density of 2x10 4 cells/cm2 in 6 plastic multiwells/ dish and allowed to grow for 24 hrs before treatment. Twenty-four hrs after seeding, the
medium was removed and fresh medium containing the drug was added for additional 24, 48, 72 and 96 hrs.
Rate of cells growth was determined counting viable cells using trypan blue exclusion assay. Doubling time
(Td) was calculated during logarithmic growth phase. The experiment was repeated twice. Statistical
analysis were performed with two way anova ( * p<0.05, **p<0.01, Bonferroni post test).

Effetti di differenziazione del compost 52E
Indirect immunofluorescence was used in order to investigate possible morphological changes of
cytoskeleton due to 52E exposure. For this experiment, SH-SY5Y were seeded on glass coverslips coated with
Cultrex® Basement Membrane Extract (BME) (Trevigen®, Gaithersburg, MD, USA) at a density of 1x105
cells/cm2 and cultured in the previously described culture media. After 24 hrs of seeding, the medium was
removed and fresh medium containing 10 microM of 52E was added. Cells were treated for additional 6 days
and medium was replaced every 48 hrs. Untreated cells and cells treated with retinoic acid (RA) 10 microM
were used respectively as non-differentiated and differentiated controls.
After treatments, cells were washed in PBS and fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1M Sørensen
phosphate buffer for 20 min at RT. Subsequently, fixed cells were blocked in PBS containing 0.3% Triton-X
100 (Merck, Darmstadt, Germany), 5% Donkey Normal Serum (Sigma Aldrich) for 1 h at RT, then incubated
overnight at +4°C in humid atmosphere with anti-neurofilament 200 (Sigma Aldrich) and anti- βIII-tubulin
(R&D) antibodies diluted 1:400 and 1:1000 respectively in blocking solution. After rinsing in PBS (2x10 min),
cells were incubated with Dylight 488-labelled secondary antisera (Thermo Scientific) diluted in 0.3% Triton-
X 100/ PBS, for 30 min at 37°C. For nuclear staining, cells were first washed in PBS then incubated 15 min
with 1 ug/ml Hoechst 33258 in 0.2% Triton-X 100 / PBS. After rinsing in PBS, coverslips containing cells were
finally mounted in 1,4-phenylendiamine (Sigma Aldrich) / glycerol 0.1%. Negative controls were performed
by primary antibody omission. NH O O H N Multiple images were acquired by using sequential laser excitations at 405 and 488 nm to reduce spectral
bleed-through artifacts.
Images from tissues were taken by Nikon Eclipse 600 microscope equipped with motorized z-stage control
and F-view II CCD Cameras with 40x objective. Immunofluorescence staining was analyzed using the Nis-
Elements Software 3.21.03 (Nikon). Analysis of βIII-tubulin and neurofilament 200 immunoreactive areas
(IR) were executed appling sherpen and detect edges filters. For each image nuclei were counted and IR/ n°
of nuclei were calculated. The experiment was repeted twice and 3 sample for each experiment (at least 100
cells) were analyzed. Statistical analysis were performed with one way anova ( * p<0.05, ***p<0.001, Tukey
post test).
Rapresentative images were collected using a Nikon A1R confocal laser-scanning microscope, equipped with
a Nikon PlanApo 60, 1.4-NA oil immersion lens. Parte Sperimentale relativa al capitolo 1.4.1 Parte Strumentale
Le reazioni di sintesi dei substrati sono state condotte in ambiente anidro e sotto atmosfera di azoto. I
solventi come metanolo (CH3OH) ed etanolo (CH3CH2OH) sono stati distillati su magnesio.
Le cromatografie su strato sottile (TLC) sono state effettuate su fogli di gel di silice pronti per l'uso, Kieselgel
60 F254 Merk, mentre i prodotti sono stati purificati cromatografia flash su gel di silice Merk 230-400 mesh.
Gli spettri 1HNMR sono stati registrati a 200 MHz su un Varian Gemini 200 oppure a 400 MHz su un Varian Gemini 400, in soluzione di CDCl3, D2O, CD3OD.
Gli spettri 13CNMR sono stati registrati a 50.3 MHz su un Varian Gemini 200 oppure a 50 MHz su un Varian Gemini 400, in soluzione di CDCl3 o D2O.
Per l'analisi gascromatografica combinata alla spettrometria di massa (GC-MS) si è usato il gascromatografo
Hewlett-Packard 5890 Series 2, con colonna capillare HP-5MS (crosslinked 5% fenil-metil silicone, lunghezza
30 m, diametro interno 0.25 mm, spessore del film 0.25 mm), collegato ad uno spettrometro di massa HP-
5971 Series (Mass Selective Detector), con potenziale di ionizzazione di 70 eV. (Programmata: 50°C 2 min.,
10°C/min. fino a 250°C, 250°C 10 min.)
Le masse delle frammentazioni sono espresse in m/z con tr si intende il tempo di ritenzione.
Per l'analisi gascromatografica su colonna achirale è stato utilizzato un gascromatografo Hewlett-Packard
6890 Series, con colonna capillare con fase stazionaria HP-5MS (crosslinked 5% fenil-metil silicone, lunghezza
30 m, diametro interno 0.25 mm, spessore del film 0.25 mm). (Programmata: 50°C 2 min., 10°C/min. fino a
250°C, 250°C 10 min.).
Le analisi in cromatografia liquida chirale ad alta pressione (chiral-HLPC) per la determinazione degli eccessi
enantiomerici sono state fatte utilizzando uno strumento Hewlett Packard 1900 liquid cromatography con
colonna chirale tipo Chiralpack IA con le seguenti caratteristiche: lunghezza 25 cm , diametro interno 0.46
cm. L'analisi è stata condotta utilizzando una miscela n-esano/isopropanolo 80/20 come fase mobile, con un
flusso costante di 0.5 mL/min. Il rilevatore dello strumento è costituito da una lampada a deuterio-visibile-
UV a lunghezza d'onda variabile tra 190 e 900 nm: si è registrata l'intensità del segnale a 210 nm.
La determinazione della conversione è stata eseguita mediante HPLC su uno strumento Hewlett Packard
1100 liquid cromatogtaphy utilizzando una colonna a fase inversa ECLIPSE XDB-C18 con le seguenti
caratteristiche: lunghezza 15 cm, diametro interno 4.6 cm. L'analisi è stata condotta utilizzando una miscela
acqua/acetonitrile 60/40 come fase mobile, con un flusso costante di 0.5 mL/min. Il rilevatore dello
strumento è costituito da una lampada a deuterio-visibile-UV a lunghezza d'onda variabile tra 190 e 900 nm,
è registrata l'intensità del segnale a 210 nm.
Gli alfa di rotazione sono stati registrati con un polarimetro UniPol L1000 Schmidt+Haensch con le seguenti
caratteristiche: lunghezza cella ottica 100 mm, lunghezza d'onda 589,30 nm.
Gli enzimi utilizzati sono: Porcine Liver Esterase (PLE), crudo liofilizzato polvere, 17 U/mg solido, prodotto da
Sigma-Aldrich, Candida antartica lipase A (CAL-A), CLEA (Cross Linked Enzyme Aggregate), '15 U/mg,
prodotto da Fluka (Sigma-Aldrich), Candida antartica lipase B (CAL-B) resina acrilica, 10000 U/g solido,
prodotta da Sigma-Aldrich e α-chimotripsina da pacreas di bovino, 42 U/mg, prodotta da Serva.

Sintesi di Reformatsky dei β lattami 54,55,56,57,10
Sintesi del reattivo organometallico
In un pallone a 3 colli da 50 mL, munito di imbuto gocciolatore e predisposto per lavorare in atmosfera
inerte, si addizionano a temperatura ambiente nell'ordine: 8 mmol di zinco metallico, 2.5 mL di THF anidro sotto agitazione magnetica. Si aggiungono 0.4 mmol di TMSCl e si lascia in agitazione per 30'. Si porta la
sospensione a 30-35°C immergendola in un bagno di olio al silicone e vi si gocciolano 4 mmol si
bromoacetato solubilizzati in 5 mL di THF anidro. Si lascia la soluzione sotto agitazione per 30' a 30-35°C e
poi la si lascia rinvenire a temperatura ambiente facendo decantare lo zinco.
Il reattivo non viene isolato a causa della sua elevata reattività, me viene lasciato sotto atmosfera inerte fino
al suo utilizzo.

Reazione di Reformatsky
In un pallone a 3 colli da 100 mL, munito di imbuto gocciolatore e predisposto a lavorare in atmosfera inerte,
a temperatura ambiente si solubilizzano nell'ordine 3.88 mmol del 4-acetossi-azetidin-2-one in 10 mL di THF
anidro sotto agitazione magnetica. Si porta la miscela di reazione a 0°C in un bagno di ghiaccio ed acqua e si
gocciolano lentamente 13.9 mmol del reattivo di Reformatsky preparato di fresco. Terminato il
gocciolamento si porta il pallone a temperatura ambiente e si segue il decorso della reazione mediante TLC.
Dopo 3-4 ore si osserva il consumo totale dello starting material. La soluzione viene spenta a freddo, in
bagno di ghiaccio ed acqua, con una soluzione satura di tartrato di sodio e potassio, sotto vigorosa
agitazione, con aggiunta di AcOEt per 30 min. Successivamente si procede con l'estrazione in imbuto
separatore con AcOEt. Le fasi organiche vengono riunite ed anidrificate su Na2SO4, concentrate al rotavapor
e seccate alla pompa da vuoto. Il prodotto viene purificato mediante flash-cromatografia

4-metossicarbonilmetil-azetidin-2-one (54) (Y = 60%) m. p. : 60-65°C; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) : δ 2.64 (dd, J = 16.8 Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 2.72 (dd, J = 15.2 Hz, J = 1.2 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 16.8 Hz, J = 4.8 Hz, 1H), 3.05 (bs, 1H), 3.21
(ddd, J = 15.2 Hz, J = 4.4 Hz, J =1.6 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 4.00 (dddd, J = 8.8 Hz, J = 4.8 Hz,
J = 1.6 Hz, J = 1.2 Hz, 1H), 6.78 (bs, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) : δ 39.48, 43.29, 43.66, 51.80, 167.24, 171.25. GC-MS (70 ev): m/z (%) 112 (13), 100 (100), 70 (60), 59 (87); IR (film, cm -1) : 3390, 1760, 1730.

4-etossicarbonilmetil-azetidin-2-one (Y = 66%) 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) : δ 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3CH2 ), 2.58 (dd, J = 16.5 Hz, J =
9.0 Hz, 1H), 2.67 (ddd, J =15.0 Hz, J = 1.3 Hz, J =1.2 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 16.5 Hz, J =
4.8 Hz, 1H), 3.77 (ddd, J = 15.0 Hz, J = 4.8 Hz, J = 2.4 Hz, 1H), 3.96 (m, 1H, CHNH), 4.17
(q, J = 7.2 Hz, 2H, CH3CH2), 6.17 (bs, 1H, NH); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) : δ 14.0, 39.7., 43.3, 43.7, 60.8, 167.3, 169.9; HPLC-MS, (ES): m/z (%) 180 (100) [M + Na +], 164 (20), 162 (20), 116 (69); IR (film, cm -1) : 3224, 2966, 1725, 1467, 1418, 1381, 1329

(4-tert
-butossicarbonilmetil-azetidin-2one) (55) (Y = 94%) m.p. : 83-84°C; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.40 (s, 9H, t-Bu), 2.76 (dd, J = 16.0 Hz, J = 8.8 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 14.8, J = 4.8, 1H), 2.88 (dd, J = 16 Hz, J = 4.8 Hz, 1H), 3.38
(ddd, J = 14.8 Hz, J = 4.8, J = 2.0, 1H), 4.15 (dddd J = 8.8 Hz, J = 4.8, J = 4.8, J = 4.8, 1H,
CHNH), 6.58 (bs, 1H, NH); 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ 28.0, 41.0, 43.3, 43.9, 81.4, 167.2, 170.1; GC-MS (70 ev): m/z (%) = 170 (7), 129 (13), 112 (13), 101 (10), 86 (12), 70 (36), 57 (100); IR (KBr,
cm -1): 3238, 2964, 1763, 1735, 1398, 1261.

(4-benzilossicarbonilmetil-azetidin-2-one) (56) (Y = 64%) m. p.: 92-92.5°C; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.57 (dd, J = 16.8 Hz, J = 9.2 Hz, 1H), 2.63 (dd, J = 14.8 Hz, J = 5.2 Hz, 1H), 2.70 (dd, J = 16.8 Hz, J = 4.8 Hz, 1H),
3.08 (ddd, J = 14.8 Hz, J = 5.2 Hz, J = 2.4 Hz, 1H), 3.89 (dddd, J = 9.2 Hz, J = 5.2
Hz, J = 5.2 Hz, J = 4.8 Hz, 1H, CHNH), 5.07 (s, 2H, CH2Ph), 6.15 (bs, 1H, NH), 7.29
(m, 5H); 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ 39.8, 43.4, 43.7, 66.7, 128.3, 128.5, 128.6, 135.3, 166.9, 170.7. HPLC-MS, (ES): m/z (%) = 439 (15) [2M + H +], 237 (40) [M + H2O], 220 (100) [M + H +]; IR (KBr, cm-1): 3238, 2961, 1738, 1460, 1372, 1262.
(4-ottilossicarbonilmetil-azetidin-2-one) (57) (Y = 54%) 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH3), 1.21-1.39 (m, 10H,
CH3(CH2)5CH2CH2O), 1.60-1.72 (m, CH3(CH2)5CH2CH2O, 2.60 (dd, J = 8.8, 16.4 Hz, 1 H, NH O O O NH O O O NH O O OCt CHCHHCO2Oct ), 2.66 (dd, J = 1.2, 14.8 Hz, 1 H, CHHCO2Oct), 2.74 (dd, J =4.8, 16.4 Hz, 1 H,
CHHCHCH2CO2Oct ), 3.17 (ddd, J = 2.0, 5.4, 14.8 Hz, 1 H, CHHCHCH2CO2tBu), 3.93-3.98 (m, 1H,
CHHCHCH2CO2tBu), 6.08 (bs, 1 H, NH) 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ 13.9, 22.5, 25.8, 28.5, 29.1 (2XC), 31.7, 39.9, 43.5, 43.8, 65.1, 167.0, 170.9. HPLC-
MS (70 ev): Rt = 8.90 min, m/z (%) = 242 (M+1), 259 (M+H2O), 264 (M+Na+), 483 (2M+1).

Idrogenolisi del (4-benzilossicarbonilmetil-azetidin-2-one) (56) a (acido 2-(4-ossoazetidin-2-il)acetico)
(58)
In un pallone a 3 colli da 50 mL, predisposto per lavorare in atmosfera di azoto ed ambiente inerte,
munito di pipa con rubinetto e a temperatura ambiente, si addizionano nell'ordine 1 mmol di 56 in 10 mL di
una miscela 1/1 di THF/MeOH anidri sotto agitazione magnetica. Si aggiunge il 10% in peso di Pd/C e si porta
l'ambiente di reazione sotto atmosfera di idrogeno (1atm). Si segue il decorso della reazione con TLC e dopo
3 ore lo starting material è completamente consumato. La soluzione viene filtrata su celite con Gouch, per
separare il catalizzatore. La frazione organica viene concertata al rotavapor, fornendo il prodotto in resa
quantitativa, come solido cristallino bianco.


(acido 2-(4-ossoazetidin-2-il)acetico) (58) m. p. : 120-125°C 1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 2.56 (dd, J = 14.0 Hz, J = 2.0 Hz, 1H), 2.58 (dd, J = 15.2 Hz, J = 2.4 Hz, 1H), 2.60 (dd, J = 14.0 Hz, J = 6.8 Hz, 1H), 3.03 (dd, J = 15.2 Hz,
J = 5.2 Hz, 1H), 3.86 (dddd, J = 5.2 Hz, J = 2.4 Hz, J = 2.0 Hz, J = 6.8 Hz, 1H). 13C NMR (CD3OD, 50 MHz): δ 39.081, 42.032, 43.809, 169.214, 173.016. IR (nujol, cm-1): 3230, 2700, 1752, 1695.

Saggi enzimatici sugli esteri β-lattamici per via enzimatica
In un vial di opportuno volume, sono state aggiunte nell'ordine 0.1 mmol di substrato, 5 mL di tampone
fosfato 0.1 M pH 7.5 e un aliquota dell'enzima. Il vial è stato chiuso e posto sotto agitazione su orbitalshaker
orizzontale a circa 700 rpm. Il monitoraggio dell'idrolisi è stato condotto prelevando ogni 0 ore, 1 ora, 2 ore,
5 ore e dopo l'overnight (24 ore) un'aliquota di 0.5 mL. Il prelievo è stato estratto con 0.5 mL di AcOEt, la
fase organica è stata svaporata al rotavapor e risospesa in 0.5 mL di isopropanolo per l'analisi in HPLC chirale.
Il volume rimanente di tampone è stato estratto con CH2Cl2, le fasi organiche sono state riunite e anidrificate
su Na2SO4, filtrate, concentrate al rotavapor e seccate alla pompa da vuoto e risospese in CDCl3 per l'analisi
NMR. La fase acquosa è stata svaporata con azeotropo con cicloesano al rotavapor ed estratta con una
soluzione 1/1 di MeOH/CH3CN. Gli estratti sono stati riuniti, anidrificati su Na2SO4, filtrati, concentrati al
rotavapor e seccati alla pompa da vuoto e risospesi in D2O per l'analisi NMR.

Sintesi del 4-ossoazetidin-2il-fosfato
4-ossooazetidin-2-il fosfato (65)
In una provetta da 50 mL, sono state aggiunte nell'ordine 0.5 mmol di 4-acetossi-
azetidin-2-one e 10 mL di tampone fosfato 0.1 M pH 7.5. Lascio in agitazione magnetica
e si segue il decorso della reazione mediante TLC (eluente AcOEt). Dopo 2-3 ore lo
starting material è completamente consumato. La soluzione viene versata in un pallone
di opportuno volume e l'acqua viene svaporata mediante azeotropo con cicloesano al rotavapor. Eliminata l'acqua si estrae il prodotto nel pallone con una soluzione 1/1 di MeOH/CH3CN. Gli
estratti sono stati riuniti, anidrificati su Na2SO4, filtrati, concentrati al rotavapor e seccati alla pompa da
vuoto. Si ottiene un solido bianco cristallino molto igroscopico. 1H NMR (D2O, 400 MHz): δ 2.75 (dd, J = 15.2 Hz, J = 4.0, 1H), δ = 3.07 (dd, J = 15.2, J = 1.2, 1H), δ = 5.42 (ddd, J = 4.0, J = 1.2, J = 6.0, 1H); 13C NMR (D2O, 50 MHz): δ 45.2 (d, J = 4.9), δ 72.7 (d, J = 3.8) δ 170.4; 31P NMR (D2O, 162 MHz): δ 1.91
Acilazione dei 4-carbonil-2-azetininoni
α-(4-(1-terbutilossicarbonil-2-osso-azetidinil))-acetato di benzile (62)
In un pallone a due colli da 50mL, precedentemente anidrificato e predisposto per
lavorare sotto atmosfera inerte (N2), si introducono 117mg (0,53mmmol) di 56 in 3
mL di DCM lasciando in agitazione qualche minuto per garantire la solubilizzazione
del solido nel solvente. In successione si aggiungono 132mg (0,61mmol) di Boc2O e
6,64mg (0,053mmol) di DMAP e si lascia la reazione a temperatura ambiente. Il
sistema di reazione vira da giallo tenue a rosso. Si lascia il reattore sotto vigorosa
agitazione per 30 minuti. Si verifica il decorso della reazione tramite TLC, con NH O OH O NH O O P O OH HO N O O O O O etilacetato/cicloesano 75/25 come miscela eluente e rivelando per ossidazione con una soluzione di
molibdato. Si evapora il solvente a rotavapor fino all''ottenimento di un olio rosso . Si purifica il grezzo per
flash-cromatografia su con una miscela etilacetato/cicloesano 25/75. Si isola un solido bianco dalle frazioni
4-14 da 10 mL ciascuna con una resa finale del 83%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.47 (s, 9H, t-Bu), 2.65 (dd, J = 16.0 Hz, J = 9,2 Hz, 1H), 2.79 (dd, J = 31,25, J = 2,8 1H), 3.20 (dd, J =8.8 Hz, J = 4.4 Hz, 1H), 3.24 (dd, J = 7.64
Hz, J = 45.11 1H), 4.24-4.29 (m J = 8.8 Hz, 1H, CHNH), 5.15 (s, 2H), 7.20-7.30 (m ,5H, Ar); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.0, 37.0, 42.7, 47.2, 66.7, 83.6, 128.3, 128.5, 128.6, 135.3, 147.6, 163.7, 169.7. GC-MS-EI (70
ev): m/z (%) = 235 (10), 177 (8), 149 (6), 103 (15), 91(100), 77(36), 57 (85); HPLC-MS-ESI +: m/z (%) = 661 (60) [2M + Na +], 337 (100) [M + H2O]; IR (KBr, cm-1): 3427, 3033, 2979, 1813, 1720


α-(4-(1-benzilossicarbonil-2-osso-azetidinil))-acetato di t
-butile (64) In un pallone a due colli da 50mL, precedentemente anidrificato e predisposto per
lavorare sotto atmosfera inerte (N2), si introducono 50mg (0,27mmmol) di 55 in 2mL di
THF, lasciando in agitazione qualche minuto per garantire la solubilizzazione del solido
nel solvente. Si porta il reattore a -78°C procedendo all''aggiunta di 0,29mL (0,29mmol)
di LiHMDS. Il sistema di reazione immediatamente passa da incolore a blu intenso. Si
lascia in agitazione per 20 minuti, e poi si aggiunge 0,29mL (0,04mmol) di CBZ-Cl ,
lasciando rinvenire la reazione per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti
dall''aggiunta del CBZ-Cl la miscela di reazione diventa nera, poi marrone e lentamente
evolve a giallo chiaro. Si verifica il decorso della reazione tramite TLC. Si spegne la reazione con NH4Cl saturo e ghiaccio, estraendo con etilacetato in imbuto separatore per tre volte, si lava
l''organico con BRINE e NaHCO3 saturo, si essicca su Na2SO4, si filtra su cotone e si rimuove il solvente al
rotavapor e successivamente alla pompa da vuoto. Si purifica il grezzo per flash-cromatografia su silice con
con una miscela etilacetato/cicloesano 20/80. Si isola un solido bianco dalle frazioni 2-4 da 10 mL ciascuna
con una resa finale del 44%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.44 (s, 9H, t-Bu), 2.58 (dd, J = 16.1 Hz, J = 9,0 Hz, 1H), 2.87 (dd, J = 16.4, J = 3.2, 1H), 3.08 (dd, J = 15.8 Hz, J = 3.8 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 16.4 Hz, J = 6.0, 1H),
4.23-4.28 (m J = 8.8 Hz, 1H, CHNH), 5.26 (s, 2H) , 7.27-7.42 (m , Ar); 13C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ 28.0, 38.0, 42.9, 47.5, 67.9, 81.5, 128.2, 128.6, 134.9, 148.8, 163.6, 168.8. GC-MS-EI (70 ev): m/z (%) = 246 (5), 107 (20),
77 (10), 91 (100), 57(67); HPLC-MS-ESI +: m/z (%) = 661 (60) [2M + Na+], 337 (100) [M + H2O] ,320 (5) [M + H+] , 264 (8) [M ''tBu +2H +] , 91 (4); IR (KBr, cm-1): 3538, 3434, 3034, 2978, 1816,1272.
Procedura di apertura chimica degli N-Acil β lattami
In un pallone a due colli da 50mL, si introducono 0,15mmmol di β lattame 5,89 mL di diossano. Si
aggiungono esattamente 6,48mL di KOH 0,05M. Si verifica il decorso della reazione tramite TLC. Dopo 2
giorni l''SM scompare: si spegne la reazione con NH4Cl saturo e ghiaccio, appurando di aver raggiunto pH
acidi, in caso è possibile aggiungere anche qualche goccia di HCl 1M per raggiungere l''acidità .Si procede
all''estrazione con etilacetato in imbuto separatore per tre volte, si essicca su Na2SO4, si filtra su cotone e si
rimuove il solvente al rotavapor e successivamente alla pompa da vuoto. Si purifica il grezzo per triturazione
con pentano. Si isola un solido cristallino bianco con una resa finale del 100%.

N
-tbutossicarbonil monoglutammato di benzile (67) 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.47 (s, 9H, t-Bu), 2.75 (m, 1H), 4.33 (bs, 1H,
CHNH), 5.13 (s, 2H), 5.39 (d, J = 7.2 Hz 1H, NH), 7.27-7.38 (m 5H, Ar); HPLC-
MS-ESI
+: m/z (%) = 661 (100) [2M + Na+], 342 (40) [M + Na+] , 265 (68) [M '' tBu +2H +]








N O O O O O NH O O O O O HO N-benzilossicarbonil monoglutammato di tbutile (66)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.46 (s, 9H, t-Bu), 2.71 (m, 1H), 4.04 (m, 1H, CHNH), 5.09 (s, 2H), 5.67 (d, J = 8.8 Hz 1H, NH), 7.27-7.38 (5H, Ar); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 27.0, 44.8, 66.7, 81.4, 128.0, 128.1, 128.2, 128.4, 128.5.9, 136.3, 155.6, 170.5,175.7; HPLC-MS-ESI +: m/z (%) = 661 (100) [2M + Na +], 342 (40) [M + Na+] , 265 (68) [M ''tBu +2H+]



Deprotezione dell''atomo di azoto
Monoglutammato di benzile (60)
In un pallone a due colli da 50mL, precedentemente anidrificato e predisposto
per lavorare sotto atmosfera inerte (N2), si introducono 46mg (0,136mmol) di 67
e 1,36mL di DCM anidro. Si aggiungono 181μL (2,448mmol) di TFA , e si lascia sotto agitazione. Si verifica il decorso della reazione tramite TLC. Dopo 4 ore circa si procede alla lavorazione
del grezzo solubilizzandolo in MeOH, si rimuovono i solventi al rotavapor e successivamente alla pompa da
vuoto. Si isola un olio giallo con un recupero del grezzo del 86%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.88 (dd, J =11.1Hz, J =4.2Hz, 4H ), 3.89 (m, 1H, CHNH ), 5.22 (s, 2H), 7.39 (m, 5H ,Ar); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 36.5, 36.9, 46.2, 68.1, 129.4, 129.6, 136.9, 171.4, 173.1; HPLC-MS-ESI +: m/z (%) = 294 (10) [M +H2O+ K+], 238 (100) [M+H +].
Monoglutammato di t-butile (63) In un pallone a tre colli da 50mL, precedentemente anidrificato e predisposto per
lavorare sotto atmosfera inerte vuoto-azoto.Si introducono 43mg (0,127mmol) di
66 , 650μL di THF anidro e 650μL di MeOH anidro. Si aggiungono 8,6mg di (0,081mmol) di Pd/C, poi si introduce l''idrogeno in eccesso e si lascia sotto agitazione .Si verifica il decorso
della reazione tramite TLC. Dopo 4 ore si procede alla lavorazione filtrando su siringa i residui solidi e
rimuovendo i solventi al rotavapor. Si isola un olio giallo con un recupero del grezzo del 30%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.51 (s, 9H, t-Bu), 2.41 (dd, J = 16.6 Hz, J = 8.6 Hz, 1H), 2.55 (dd, J = 16.8Hz, J = 5.00Hz 1H), 3.75
(m, 1H, CHNH); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 29.1, 39.2, 39.6, 48.3, 83.96, 172.2, 177.9; HPLC-MS-ESI+: m/z (%) = 242(10) [M + K +], 226 (29) [M + Na+], 204(100) [M+H+], 148(41) [M + tBu+ 2H+]
Tempi di ritenzione HPLC Chirale
55)
IA, 0.5 mL/min, 80/20 n.esano/isopropanolo: 1° enantiomero: 13.6 min; 2° enantiomero: 14.2
56) IA, 0.5 mL/min, 80/20 n.esano/isopropanolo: (S) 15.3 min: (R) 16.3 min.
57) IA, 0.5 mL/min, 80/20 n.esano/isopropanolo: (S) 9.7 min: (R) 10.4 min.
67) IA, 0.5 mL/min, 75/25: n-esano/i-propanolo. 1° enantiomero: 11.67 min: 2° enantiomero 13.64 min.
66) IA, 0.5 mL/min, 96/4: n-esano/i-propanolo. S): 23.88 min: R) 24.82 min.


















NH O O O O O HO HOOC COOBn NH2 HOOC COOtbu NH2 2
I profeni
2.1 acidi 2-Aril Propionici
La scoperta dei Profeni risale ai primi anni 60 e si deve agli scienziati Adams, Nicholson and Burrows. gli acidi
2-aril propionici o Profeni sono tra gli agenti antiinfiammatori non steroidei (FANS) più diffusi e utilizzati al
mondo. 97 Tutta la classe dei Profeni è caratterizzata dallo scheletro dell''acido 2-aril propanoico, in cui il secondo
carbonio è chirale. Sopra sono rappresentate alcune delle strutture dei Profeni più comuni: ibuprofene,
naprossene, chetoprofene, flurbiprofene e fenoprofene.
I Profeni svolgono la loro azione antiinfiammatoria agendo sul metabolismodell'acido arachidonicoe
dell'acido eicosapentenoico, precursori di molecole coinvolte nel processo infiammatorio
quali prostaglandine, prostacicline, trombossani e leucotrieni. I FANS interagiscono in maniera più o meno
reversibile legandosi al sito attivo di un enzima, la cicloossigenasi, di cui esistono due forme: l''enzima COX-1
e il COX-2. Ciascuna classe di antinfiiammatori ha una selettività differente verso COX-1 e COX-2; tale
specificità è alla base per la ricerca farmacologica e per la comprensione e la risoluzione dei problemi legati
alla tossicità di alcuni di questi farmaci.
La configurazione del centro stereogenico non è indifferente per i Profeni: ciascun enantiomero ha infatti
differenti proprietà farmacologiche nonché farmacodinamiche. 98L''isomero che in effetti esplica proprietà antiinfiammatoria risulta essere quello con configurazione S, il quale si qualifica quindi come l''eutomero.
L''altro enantiomero, l''R, risulta quindi essere il distomero. 99,100 Queste differenti proprietà dei due enatiomeri sono state però delucidate solo di recente. L''enantiomero R
sembra infatti non avere alcuna attività specifica anche se studi recenti stanno smentendo questa ipotesi,
mostrando che anche questo stereoisomero non è inattivo. La tendenza è quella di vendere e somministrare
i Profeni in forma racema ad eccezione del Naprossene, in cui l''enantiomero R provoca gravi danni al fegato.
Gli studi stanno rivelando che la somministrazione di una miscela racemica di ibuprofene in vivo porta
all''arricchimento del Profene verso la forma S. Il meccanismo 101,102,103 più probabile di tale inversione, proposto per la prima volta da Nakamura e collaboratori 104, è un processo a tre passaggi che inizia con la formazione di un tioestere, attraverso una catalisi enzimatica enantiospecifica, tra l''enantiomero R dell''acido
2-arilpropionico e il coenzima A (CoA). Tale tioestere a sua volta può subire idrolisi e quindi generare
nuovamente l''acido R, oppure subire epimerizzazione producendo l''estere S. Successivamente l''idrolisi del
(S)-CoA tioestere completa il processo di inversione, dando l''acido S (Figura 6.4).

97 E.Emer, ''Acqua: solvente elettivo in organocatalisi e biocatalisi', Tesi di dottorato, 2009.
98 Adams, S.S.; Bresloff, P.; Mason, C.G. J. Pharm. Pharmacol., 1976, 28, 256.
99 Campbell, D.B. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin., 1990, 5, 109. 100 Bye, A. Round Table Series, 1990, 18, 9.
101 Chen, C.S.; Shieh, W.R.; Lu, P.H., Harriman S, Chen CY, Biochim Biophys Acta, 1991, 1078, (3), 411''7. 102 Tracy, T.S.; Hall, S.D., Drug Metab Dispos , 1992, 20, (2), 322''7. 103 Reichel C, Brugger R, Bang H, Geisslinger G, Brune K, Mol Pharmacol, 1997, 51 (4), 576''82. 104 Nakamura, Y.; Yamaguchi, T.; Takahashi, S.; Hashimoto, S.; Iwatani, K.; Nakagawa, Y. J. Pharmacobiodyn., 1981,4, S-1. O O H O n a p r o s s e n e O H O i b u p r o fe n e O H O c h e to p r o fe n e O O H O f e n o p r o fe n e O O H O f lu r b ip r o fe n e F
Il processo di epimerizzazione può procedere non enzimaticamente, vista la particolare acidità dell''idrogeno
legato al carbonio in α al tioestere. Questo processo è clinicamente importante poiché porta alla formazione
dell''inibitore attivo della ciclo-ossigenasi, a partire dal precursore inattivo. Tale meccanismo di risoluzione
dinamica, comunque, varia in vivo da specie a specie e da individuo ad individuo e certamente non è
tutt''oggi completamente chiarito 105,106. Inoltre, questa inversione metabolica talvolta avviene dopo la somministrazione, nella fase di eliminazione, quando la concentrazione nel plasma del Profene iniziale S è
marcatamente più bassa e il suo effetto terapeutico è ormai nullo. Questo fenomeno di inversione quindi
non può essere considerato un ''prodrug principle'' 107 e non permette si conoscere la quantità reale di S Profene somministrata. Attraverso la via metabolica vista sopra, gli enantiomeri R possono avere effetti
farmacologici e tossicologici verso l''inibizione nella sintesi delle prostaglandine. L''abilità degli enantiomeri R
di formare potenziali acilglucironidi reattivi, tioesteri col coenzima A, ad essere incorporati in triacigliceroli, e
quindi la possibilità di interferire col metabolismo dei lipidi e di interferire nei processi legati alle membrane
biologiche, li rende farmacologicamente a rischio.
Sebbene il paziente venga esposto a due diverse ''entità' chimiche, nel caso in cui il NSAID venga
somministrato in forma racema, non esistono ancora prove che dimostrino una palese tossicità
dell''enantiomero R. In ogni caso i vantaggi nella somministrazione del solo enantiomero S sono i seguenti:
ridurre il carico dello smaltimento del farmaco sul metabolismo e in particolare sui reni;
ridurre al minimo gli effetti collaterali dovuti all''enantiomero R e ai suoi metaboliti;
effetti collaterali e azione coadiuvata con altri farmaci sulla farmacocinetica del NAID, sarebbero più facili da
valutare e come conseguenza può essere valutato meglio il dosaggio;
Ridurre le interazioni del NSAID con altri farmaci;
eliminare le interazioni enantiomero-enantiomero (che possono portare ad effetti non lineari nelle
farmacocinetiche dell''enantiomero attivo);
eemplificare le proprietà farmacocinetiche e dosi metaboliche del farmaco;
per quegli acidi arilpropionici che subiscono inversione dello stereocentro (es. ibuprofen), la variabilità e il
rapporto d''inversione tra individuo ed individuo vengono annullate;
- semplificare i rapporti tra le concentrazioni del farmaco nel plasma o nel fluido sinoviale e la risposta
terapeutica: metodi enantioselettivi non hanno bisogno di misurare le concentrazioni di farmaco
somministrato e non legato 108; - sn vivo, l''enatiomero puro degli acidi 2-arilpropionici viene assorbito più velocemente rispetto al
composto racemo 109; - sel caso dell''ibuprofen racemo c''è bisogno del doppio della dose per avere la stessa concentrazione
dell''isomero S nel sangue 110,111.
105 Rudy, A.C.; Knight, P.M.; Brater, D.C.; Hall, S.D. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1991, 259, 1133. 106 Lee, E.J.D.; Williams, K.; Day, R.; Graham, G.; Champion, D. Br. J. Clin. Pharmac. 1985, 19, 669. 107 Loew, D.; Rau, G.; Schuster, O. Dtsch. Apoth. Ztg., 1989, 129, 2505. 108 Evans, A.M. Eur.J. Clin. Pharmacol. 1992, 42, 237 e I riferimenti al suo interno. 109 Stock, K.P.; Geisslinger, G.; Loew, D.; Beck, W.S.; Bach, G.L.; Brune, K. Rheumatol. Int., 1991, 11, 199. 110 Geisslinger, G.; Schuster, O.; Stock, K.P.; Loew, D.; Bach, G.L.; Brune, K. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1990, 38, 493. 111 Brown, J.M. Science 1992, 257, 1847. 2.2 Metodologie di sintesi di (S)-Profeni
Dalla scoperta dei Profeni come importante classe di FANS, si sono susseguiti in quest''ambito numerosi
articoli e brevetti che trattano della sintesi di Profeni enantiomericamente arricchiti. In letteratura esistono
ormai numerose metodologie sintetiche ma è soprattutto negli ultimi anni che la biocatalisi sta giocando un
ruolo molto importante in questo importante ambito.

Metologie chimiche 19 Idrogenazione di acidi 2-arilpropenoici
Acidi saturi otticamente attivi come i profen possono essere sintetizzati a partire da acidi α,β- insaturi,
attraverso una idrogenazione asimmetrica. Complessi del rutenio come il [BINAP-Ru dicarbossilato]
idrogenano acidi arilpropenoici prochirali con un''ottima resa e con una purezza ottica del 97% 112.

Idroformilazione di stireni
L''idroformilazione enantioselettiva della specie stirenica catalizzata da platino, in presenza di stagno
dicloruro 113, porta alla formazione dell''aldeide con un eccesso enantiomerico del 73%. Tale stereosettività può essere portata al 96% nel caso in cui venga utilizzato il trietilortoformato, che previene la
racemizzazione dell''aldeide derivante dalla chetalizzazione. L''ossidazione dell''aldeide con KMnO4 porta alla
formazione del naprossene S.

Idrocarbossilazione di olefine
La reazione di idrocarbossilazione in presenza di un catalizzatore chirale porta alla formazione di acidi
sostituiti con alte rese, lavorando a temperatura ambiente e a pressione atmosferica. 112 Noyori, R.; Nagai, K,; Kitamura, M. J. Org. Chem., 1987, 52, 3176. 113 Stille, J.K.; Parinello, G. J. Mol. Cat., 1983, 21, 203.
Epossidazione di Katsuki-Sharpless
Epossi-alcoli chirali sono intermedi sintetici versatili. L''epossidazione dell''alcool cinnamico 1.12 (R=H)
attraverso il metodo di Katsuki-Sharpless, seguito dall''apertura alchilica tramite MeI, porta alla formazione di
un nuovo centro stereogenico benzilico (1.13). Scegliendo il giusto agente alchilante è possibile ottenere
entrambi gli enantiomeri a partire dallo stesso precursore epossidico. 114 Una variante è l''idrogenolisi dell''epossido asimmetrico (R= Me) attraverso l''epossidazione di Sharpless che
porta alla formazione solamente del diolo 2R, 3S 115.
Acilazione di Friedel-Crafts di composti aromatici
Le condizioni acide della reazione di Friedel-Crafts permettono di associare l''acilazione asimmetrica ad un
processo di racemizzazione. Tale reazione, con l''ausilio di AlCl3 e in presenza del derivato dell''acido lattico,
porta alla formazione dell''estere metilico con un eccesso del 98% ma con una resa del 50% 116.

Reazioni di coupling col Grignard
E'' possibile ottenere il naprossene S con un ee del 64% facendo reagire il Grignard 1.16 col composto 1.17
enantioselettivamente, attraverso un catalisi organometallica (complesso nickel-chiraphos) 117 .
114 a) Katsuki, T.; Sharpless, K.B. J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, 5974. b) Takano, S.; Yanase, M.; Ogasawara, K.
Heterocycles, 1989, 29, 1849. 115 Coghlan, D.R.; Hamon, P.G.; Massy-Westropp, R.A.; Slobedman, D. Tetrahedron: Asymmetry, 1990, 1, 299. 116 a) Piccolo, O.; Spreafico, F.; Visentin, G. J. Org. Chem., 1985, 50, 3946. b) Piccolo, O.; Azzena, U.; Melloni, G.;
Delogu, G.; Valoti, E. J. Org. Chem., 1991, 56, 183. 117 Hiyami, T.; Wasaka, N. Tetrahedron Lett., 1985, 26, 3259.
Protonazione enantioselettiva
L''acil cloruro racemico 1.20 può essere trasformato nel corrispettivo chetene prochirale. L''addizione di una
specie R*OH (α-idrossiacidi o lattoni) al chetene porta alla formazione di un estere del corrispondente acido
arilpropionico con un''alta disteroselettività e successivamente, attraverso l''idrolisi dell''estere, è possibile
ottenere l''acido desiderato. Nel caso in cui venga utilizzato l''R-pantolattone, si ottiene quasi esclusivamente
il naprossene R 118. Risoluzione di sali diasteromerici; risoluzione cinetica ed enzimatica
Nel campo dei composti enatiomericamente puri, la risoluzione di racemi resta sempre una valida
alternativa. La formazione diasteromerica di un sale tra il naprossene racemo con la (-)-cinconidina permette
di ottenere il profen S nella forma pura, con una resa del 49% 119. La miscela diasteromerica dell''anidride del naprossene racemo può essere cineticamente risolta facendola reagire con (R)-(+)-1-(4-piridil)etanolo, ed
ottenendo in questo modo il naprossene S con una resa dell''81% e un ee del 55% 120.
Metologie biocatalitiche
121 Le metodologie enzimatiche offrono sicuramente il miglior compromesso tra sostenibilità e purezza
enantiomerica dei Profeni sintetizzati. Tuttavia tutte le metodologie proposte fino ad ora, seppure valide,
stentano ad affacciarsi sul mercato per ragioni di natura tecnica/economica. Il problema principale è il costo
del biocatalizzatore, enzima o cellula viva che sia, associato alla difficoltà nella sua riciclabilità rispetto ad un
catalizzatore organico.
Gli enzimi utilizzati per queste trasformazioni sono molteplici come lo sono gli starting material e svolgono
importanti processi di risoluzione cinetica, risoluzione cinetico dinamica, racemizzazione e deracemizzazione.
118 Larsen R.D.; Corley, E.G.; Davis, P.; Reider, P.J.; Grabowski, E.J.J. J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 7650.
119 Harrison, I.T.; Lewis, B.; Nelson, P.; Rooks, W.; Ruzkowki, R.; Tomolonis, A.; Fried, J.H. J. Med. Chem., 1970, 13, 203.
120 Frank, A.; Ruchardt, C. Chemistry Lett., 1984, 1431. 121 R. Kourist, P. Domiguez de Maria and K. Miyamoto, Green Chem., 2011, 13, 2607.

Idrolasi
Esterasi
L''approccio che utilizza la risoluzione cinetica delle idrolasi o esterasi è stato uno dei primi metodi
biocatalitici per la sintesi degli S-Profeni 122 e ancora oggi mostra grandi potenzialità. Questi processi, molto numerosi, si applicano spesso sugli scheletri Profenici. La reazione può essere fatta in solvente acquoso su
una miscela racema di esteri Profenisi con l''idrolisi selettiva solo dell''estere S, oppure si può svolgere la
reazione sui Profeni racemi ed esterificare solo l''R.

Tra gli enzimi utilizzati, uno dall''organismo Bacillus e una da Serratia Marcescens

Conversione del gruppo nitrile 122 W. J. Quax and C. P. Broekhuizen, Appl.Microbiol. Biotechnol., 1994, 41, 425''431 Gli enzimi che agiscono sul gruppo nitrile, considerati sempre delle idrolasi, sono tre e sono rappresentati in
questo schema. La loro importanza è relativa alla sintesi di molte molecole bioattive. 123 Le amidasi di natura microbiologica offrono spesso alti livelli di (S)-enantioselettività nei confronti delle
profenammidi, 124 e spesso sono riportate sintesi da parte di sistemi di nitrile idratasi/amidasi da parte di cellule intere. D''altra parte però la stereoselettività delle sole nitrile idratasi è davvero poco frequente
nell''ambito dei profeni. Ma le nitrilasi, stanno ricevendo sempre più attenzione, a partire dal primo esempio
interessante ottenuto utilizzando delle cellule intere di Acineto Bacter. 125
Liasi
Tra le metodologie che sfruttano le liasi, si annovera l''utilizzo delle aril-malonato carbossilasi da Bordatella
bronchoseptic. Questi enzimi catalizzano sfruttano la desimmetrizzazione degli acidi α-aril-α-metil malonici,
tramite decarbossilazione, portando teoreticamente a delle rese fino al 100%. 126 Molte limitazioni all''utilizzo di questi enzimi sono legate alla facilità con cui vengono inibiti e alla più
frequente formazione dell''enantiomero non desiderato, l''R.

Isomerasi
Miyamoto and Ohta 127 hanno riportato il riarrangiamento di epossidi con l''utilizzo di una stirene ossido isomerasi ricombinante da Pseudomonas Putida.
Il 2-metil-stirene ossido isomerizza infatti alla relativa 2-fenil propanale che poi tramite ossidazione può
essere trasformata nell''acido.

Ossidoreduttasi 123a) R. N. Thuku, D. Brady, M. J. Benedik and B. T. Sewell, J. Appl. Microbiol., 2009, 106, 703''727; b) S. Van Pelt, F. Van Rantwijk and R. A. Sheldon,
Chim. Oggi-Chem. Today, 2008, 26, 2''4; c) M. X. Wang, Chimia, 2009, 63, 331''333.
124 M. X. Wang, G. Lu, G. J. Ji, Z. T. Huang, O. Meth-Cohn and J. Colby, Tetrahedron: Asymmetry, 2000, 11, 1123''1135.
125 K. Yamamoto, Y. Ueno, K. Otsubo, K. Kawakami and K. I. Komatsu, Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56, 3125''3129.
126 K. Miyamoto and H. Ohta, Eur. J. Biochem., 1992, 210, 475''481.
127 K. Miyamoto, K. Okuro and H. Ohta, Tetrahedron Lett., 2007, 48,3255''3257 I metodi che sfruttano le deidrogenasi sono stati ampiamente trattati dal mio gruppo di ricerca, che è stato il
primo nel 2007 a proporre una sintesi di 2S-profenoli (diretti precursori degli S Profeni) a partire dalle relativi
2-profenali raceme tramite una bioriduzione enantioselettiva con risoluzione cinetico dinamica (DKR)
utilizzando l''enzima HLADH 128. Sono usciti successivamente altri studi che utilizzano la DKR con deidrogenasi; Bakvall 129 sfrutta lo stesso meccanismo di DKR ma partendo dal 2-fenil propanolo racemo.
Una lipasi Amano Lipase PS-D da Burkholderia cepacia acila direttamente e selettivamente l''alcol S; l''alcol R
che non reagisce, viene ossidato ad aldeide tramite il catalizzatore si Shvo 130, la quale racemizza e viene nuovamente ridotta sempre dal catalizzatore si Shvo. Racemizzando e riducendosi si ottiene di nuovo in
parte dell''alcol S, che viene nuovamente acilato.
Ancora più recentemente è uscito un articolo sull''utilizzo di aldeide deidrogenasi in grado di ossidare solo la
2R-fenil propanale ad acido carbossilico, sfruttando sempre la DKR tra l''aldeide R e l''aldeide S 131.
Tuttavia la reazione porta all''R profene e non all''S e non risultano per ora applicazioni ai Profeni.
Un''ultima interessante applicazione delle riduttasi è l''utilizzo di una ene-reduttasi da Bacillus Subtilis su
enoati 132, che però anche in questo caso porta alla sintesi di derivati R-Profenici. 128 D. Giacomini, P. Galletti, A. Quintavalla, G. Gucciardo and F. Paradisi, Chem. Commun., 2007, 403
129 D. Strubing, P. Krumlinde, J. Piera, and J. Backvall, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1577 '' 1581 130 Shvo, Y.; Czarkie, D.; Rahamim, Y., J. Am. Chem. Soc. 1986, 108 (23) 7400''2.
131 P.l Kçnst, H. Merkens, S. Kara, S. Kochius, A. Vogel, R. Zuhse, D.Holtmann, I. Arends, and F. HollmannAngew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 9914 ''9917

2.3 Metodo chemoenzimatico per la sintesi di (S
)-Profeni con alcool deidrogenasi
Il gruppo di ricerca in cui ho svolto il mio dottorato si occupa da moltissimo tempo della sintesi dei Profeni
enantiomericamente puri. L''approccio utilizzato è una sintesi chemoenzimatica che parte dalle aldeidi 2-
arilpropioniche raceme, come è stato accennato nel paragrafo precedente. Il primo step prevede una
bioriduzione enantioselettiva mediata dall''enzima HLADH (naturale, clonato e modificato) concomitante ad
una risoluzione cinetico-dinamica a dare i 2S-aril propanoli; Il secondo step è un''ossidazione, che può essere
effettuata chimicamente oppure tramite metodologie biocatalitiche.
R HLADH buffer / organic solvent R (R,S) (S) OH O H OH O yields up to 99% (S)/(R) up to 99:1 R (S) OH O NaClO, TEMPO yields up to 99% (S)/(R) up to 99:1 NADH NAD+ NaClO2 TEMPO, O2 Laccase oppure



2.3.1 Primo Step: Sintesi enantioselettiva di 2(S)-Aril Propanoli mediata dall''enzima HLADH
133 Questa metodologia sintetica prevede la sintesi di 2(S)-arilpropanoli enantiomericamente puri, a partire da
aldeidi 2-arilpropiliche raceme, attraverso a riduzione enantioselettiva
Lo step di riduzione enzimatica per opera di uno specifico enzima alcool deidrogenasi (ADH): l''Horse Liver
Alcohol Dehydrogenase (HLADH), estratto da fegato di cavallo.

Horse Liver Alcohol Dehydrogenase (HLADH)
L'' Horse Liver Alcohol Dehydrogenase (HLADH) (Figura 7.1) è un importante enzima NADH dipendente
appartenente alla classe I delle Alcohol Dehydrogenase. E'' composto da due monomeri del peso di 40,000
Da ciascuno 134. Ogni subunità può esistere in due forme isomorfe chiamate S ed E. I monomeri possono formare omodimeri
EE ed SS oppure dar vita l''eterodimero ES. In base al tipo di isoenzima formato, l''HLADH risulta più attivo
verso substrati come l''etanolo (isoenzima EE) o molecole steroidee (isoenzima SS) 135. Questa peculiarità permette all''HLADH di ossidare un vasto spettro di alcoli primari a catena lineare e ramificata, secondari,
alcoli ciclici e steroidi. I monomeri E ed S differiscono tra loro di 10 aminoacidi (l''E è composto da 374 aa,
mentre l''S da 384 aa). Alcuni di questi amminoacidi modificati sono coinvolti nella formazione del sito attivo,
e quindi spiegano il motivo per cui l''isoenzima SS sia in grado di catalizzare substrati di grosse dimensioni 132 J.Pietruszka and M. Schçlzel, Adv. Synth. Catal. 2012, 354, 751 '' 756
133 P. Galletti, E.Emer, G. Gucciardo, A. Quintavalla, M. Pori, D. Giacomini, Organic and Biomolecular Chemistry, 2010, 8, 4117''4123
134 Vedi: Wothington Enzyme Manual (www.worthington-biochem.com) Drum et al. 1967; Blomquist et al. 1967 135 Jörnvall, 1970, Andersson et al. 1974 come steroidi. Ogni monomero possiede due atomi di zinco, uno posizionato nel sito attivo e coordinato a
due cisteine e una istidina l''altro, coordinato a quattro cisteine ed avente solamente una funzione
strutturale.
L''HLADH è un enzima NADH dipendente, se paragonato all''Yeast Alcohol Dehydrogenase (YADH)
comunemente impiegato nella riduzione dei chetoni, risulta essere più selettivo e più stabile in condizioni di
stress biologico come le alte temperature e la presenza di piccole quantità solventi organici utilizzati come
co-solventi

Prime prove di riduzione: la 2-fenilpropanale (1a)
Per mettere a punto la reazione di riduzione è stato scelto una aldeide arilpropionica come modello, 2-
fenilpropanale (1a), caratterizzata da un gruppo arilico non sostituito, disponibile commercialmente in forma
racema. Tale aldeide è stata dispersa in una soluzione di tampone fosfato 0.1M (pH 7.5) ad una
concentrazione 0.5 mM ed è stata messa a reagire con 0.01 mg/ml di HLADH e con NADH alla
concentrazione 1mM.

La reazione è stata seguita nel tempo tramite HPLC e la conversione è stata monitorata tramite retta di
taratura dell''alcool racemo puro, mentre l''eccesso enantiomerico è stato determinato tramite HPLC chirale
(Tabella 1). I risultati mostrano la conversione in alcool maggiore dell''80% dopo appena 5 ore ed un rapporto
enantiomerico S/R del prodotto di 82:18 Tali valori rimangono pressoché invariati anche dopo 24 ore.
Tabella 1 caso durata HLADH resa S% R% (ore) (mg/mL) (%) 1 a 5 0,01 81,10 82 18 2 a 24 0,01 88,5 81 19 3 a 5 0,002 75,1 >99 nd 4 a 24 0,002 89,1 95 5 5 b 5 0,01 88,7 84 16 6 b 24 0,01 99,4 83 17

Anche riducendo la quantità di enzima non si osserva un abbassamento delle rese, mentre si riscontra un
aumento dell''eccesso enantiomerico a favore dell''alcool S fino alla completa scomparsa dell''altro
enantiomero (Tabella 1, casi 3 e 4).
Per rendere il processo economicamente vantaggioso, oltre ad abbassare a 0.002 mg/ml la quantità di
enzima, è stato messo a punto un sistema di riciclo del cofattore (Tabella 2). Per fare questo è stato aggiunto
all''ambiente di reazione dell''etanolo. Quest''ultimo reagendo con l''HLADH ed il NAD + prodotto dal processo di riduzione del fenipropanale, viene ossidato ad acetaldeide, producendo al contempo NADH. I dati 5 e 6 in
tabella mostrano che l''introduzione dell''etanolo oltre a riciclare il cofattore, non modifica la resa e la
stereoselettività della riduzione. Condizioni di reazione: [a] 2-fenilpropanale 0.5 mM, NADH 1 mM;
[b] 2-fenilproanale 0.5 mM, NADH 0.01 mM, etanolo 0.5 M
Questi dati, sebbene derivino da prove preliminari mostrano che 1)l''HLADH è enzima specifico verso questo
tipo di substrati e che la sua catalisi porta alla formazione dell''alcool S, precursore dei Profen, 2) il processo è
caratterizzato da una risoluzione di tipo cinetico-dinamico e non solamente di tipo cinetico.
Tabella 2 caso durata HLADH resa S% R% (ore) (mg/mL) (%) 1 a 27 0,002 96,20 96 4 2 b 27 0,002 94,7 95 5


Per valutare la fondatezza delle nostre ipotesi, ovvero di un meccanismo DKR, è stata preparata l''(2R)-2-
fenilpropanale ed è stata ridotta nelle condizioni di reazione viste sopra.
Anche in questo caso la conversione è quantitativa ed osserviamo l''inversione dello stereocentro e quindi la
formazione dell''alcool S.
I risultati ottenuti da queste prove ci hanno permesso di ipotizzare di essere nelle condizioni di una
risoluzione cinetico-dinamica. Innanzitutto, essendo l''HLADH un enzima specifico verso l''aldeide S, la velocità
di riduzione di questo enantiomero è molto maggiore rispetto alla specie R; e grazie a questo si ottengono
ottimi l''eccessi enantiomerici. Poiché dal processo si ottengono rese quantitative e non solamente del 50%,
come nel caso di una semplice risoluzione cinetica, si considera la possibilità di una risoluzione cinetico-
dinamica. Tutto ciò è possibile poiché in soluzione, l''aldeide subisce un continuo equilibrio di
racemizzazione, passando attraverso la forma enolica 136. 136 C. C. Gruber, I. Lavandera, K. Faber and W. Kroutila, Adv. Synth. Catal., 2006, 348, 1789''1805. Condizioni di reazione: [a] (R)-2-fenilpropanale 0.5 mM, NADH 1
mM;[b] (R)-2-fenilproanale 0.5 mM, NADH 0.01 mM, etanolo
0.5 M
La bassa solubilità del 2-fenilproanale in soluzione tampone non consente di svolgere tale processo su grosse
quantità e tanto meno di ridurre le altre aldeidi 2-arilpropionche, molto più lipofile. Per questo motivo si è
voluta provare l''aggiunta di diversi co-solventi organici all''ambiente acquoso: CH3CN, THF ed esano. In
questo modo si sono testati tre diverse tipologie di solventi: il primo completamente miscibile in acqua, il
secondo parzialmente miscibile ed il terzo immiscibile.
L''utilizzo di CH3CN e THF al 10% (v/v) rispetto alla soluzione tampone viene ben tollerato dall''enzima (Tabella
3). Gli eccessi enantiomerici sono maggiori col THF (10%) rispetto al CH3CN (10%), sebbene le rese ottenute
siano inferiori.
Buoni risultati si sono ottenuti su quantità maggiori di substrato impiegando CH3CN al 16% ed utilizzando il
riciclo del cofattore (Tabella 3, caso 2). Anche in questo caso, dopo purificazione cromatografica si è
ottenuta una resa quantitativa (90%) e una buona enantioselettività (94%) del (2S)-2-fenilpropanolo.
Tabella 3 caso cosolvente (%) durata (ore) HLADH (mg/ml) resa (%) S% R% 1 a CH3CN (10) 5 0,01 71,9 89 11 2 b CH3CN (16) 96 0,09 90,3 94 6 3 a THF (10) 5 0,01 54,7 96 4 4 c THF (10) 5 0,01 54,1 95 5 5 a esano (90) 5 0,2 69,9 74 26 6 a esano (95) 5 0,2 80,3 64 36 7 c esano (95) 5 0,2 68 72 28 8 c esano (99) 5 0,2 54,6 90 10




Aggiungendo 10% di esano la reazione non procede, mentre impiegandone una grande quantità (90-99%
v/v) e aggiungendo un eccesso di enzima e di NADH direttamente alla miscela di reazione, sotto forte
agitazione, la reazione procede bene, dando in alcuni casi rese molto superiori al 50% (Tabella 3, esempio 6).
Studi cromatografici hanno mostrato al procedere della reazione di riduzione, la formazione di un
sottoprodotto che da analisi HPLC-MS, 1HNMR e GC-MS, risulta acetofenone. Condizioni di reazione: [a] 2-fenilpropanale 0.5 mM, NADH 1 mM; [b] 2-
fenilpropanale (1 mmol 0.045 M), NADH (1 mmol), EtOH (5.1 mmol) in 24 mL
di tampone-CH3CN (16%), resa dopo colonna flash; [c] 2-fenilpropanale 0.5
mM, NADH 0.01 mM, EtOH 0.5 M.
Studi successivi inoltre, hanno dimostrato che la formazione di tale chetone non è causata dall''enzima, ma
dall''ambiente acquoso di reazione ed in particolare dal suo pH. Per questo motivo si è provato ad utilizzare
un diverso tampone acquoso (tampone pirofosfato) ad un pH leggermente superiore a quello usato in
precedenza (pH 8.0 anziché 7.5).
Visto che la presenza di un co-solvente organico al passare del tempo, denatura la struttura enzimatica,
disattivando il catalizzatore e quindi la catalisi, si è deciso di aggiungere una seconda aliquota di enzima dopo
5 ore di reazione.
I risultati raccolti (Tabella 4) dimostrano che a pH 8.0 l''enzima mantiene un''ottima enantioselettività,
soprattutto con CH3CN e THF al 10% (Tabella 4, esempi 2 e 3), inoltre, l''aggiunta di una seconda aliquota di
enzima, consente in presenza di co-solvente di aumentare nettamente la resa ('80%).
Tabella 4 cosolvente (%) durata (ore) HLADH (mg/ml) resa (%) S% R% 1 - 24 0,01 99 83 17 2 CH3CN (10) 24 0,01 84 98 2 3 THF (10) 24 0,01 80 99 1 4 THF (5) 24 0,01 88 95 5



Estensione alle altri aldeidi alrilpropioniche: Ibuprofenale, Flurbiprofenale, Fenoprofenale, Naprossenale e
Ketoprofenale

Abbiamo successivamente esteso lo studio di bioriduzione enzimatica con l''HLADH alle altre 2-aril propanali,
importanti precursori dei Profeni. Le aldeidi raceme non sono commercialmente disponibili e sono state
ottenute in due passaggi (descritti nella parte sperimentale) a partire dagli acidi 2-aril propionici.
O Tampone fosfato pH 8.0, 0.1M, NADH 0.01mM, EtOH 0.5M, T=rt. In tutti i casi
aggiunta una seconda aliquota di HLADH dopo 5 ore H O H H F H O H O O O O O O 1b, ibuprofenal 1c, flurbiprofenal 1d, fenoprofenal 1e, naproxenal 1f, ketoprofenal
Anche in questo caso le reazioni di bioriduzione sono state effettuate utilizzando il NADH in presenza di EtOH
utilizzando la metodologia del riciclo del cofattore. Tabella 5 I primi risultati osservati hanno mostrato per l''ibuprofenale 1b e per la flurbiprofenale 1c ottimi risultati
intermini di resa ed enantioselettività utilizzando il 10% di MeCN in tampone fosfatao a pH 7.5, 0.1 Molare.
(Tabella 5). Per quanto riguarda la fenoprofenale 1d, il rapporto S/R in queste condizioni non è risultato
soddisfacente ma è stato migliorato aumentando il pH e abbassando la quantità di enzima utilizzata; in
particolare si è proceduto inserendo l''enzima in due aliquote a tempi differenti. Per quanto riguarda la
naprossenale, il rapporto enantiomerico è risultato buono ma non le rese, anche se valori maggiori del 50%
ci hanno comunque suggerito che intervenisse il fenomeno della risoluzione cinetico-dinamica. In tutti i casi,
tutte e quattro le aldeidi hanno fornito l''S come enantiomero maggioritario.
La determinazione della configurazione è stata fatta con diverse strategie. Per gli alcoli 2b e 2e, la
configurazione è stata assegnata paragonandoli a campioni di (S)-alcoli ottenuti per riduzione degli (S)-acidi
commerciali con BH3 SMe2. Per la determinazione della configurazione di 2c e 2d (i cui (S)-acidi non sono commerciali), si è effettuata la
bioriduzione enzimatica molto in grande (in scala semipreparativa) e gli alcoli ottenuti sono stati ossidati ai
corrispondenti (S)-Profeni con KMnO4 in acetone. E'' stata poi misurata la rotazione ottica con i dati presenti
in letteratura, confermando la configurazione S.
In particolare, l''ossidazione con KMnO4 non ha causato la racemizzazione di nessuno dei due alcoli.
Su tutte le prove effettuate, le analisi del grezzo di reazione quando le rese non erano quantitative, non è
stata osservata la presenza di aldeide ma del corrispondente arilchetone. In particolare la naprossenale 1e
ha sempre portato a quantitativi di arilchetone 3e molto superiori a quelli delle altre aldeidi.
L''ultima aldeide 2-aril propionica studiata è stata la Ketoprofenale (1f). L''interesse relativo a questo
composto è dovuto alla contemporanea presenza di due gruppi carbonilici, uno aldeidico e uno chetonico.
HLADH buffer / organic solvent (R,S) O H OH O NADH NAD+ O OH O Tabella 6 L''HLADH ha dimostrato un elevato grado di chemoselettività producendo come unico composto il chetoalcol
2f desiderato in alte rese. Non sono state trovate infatti tracce della possibile riduzione del chetone (l''idrossi
aldeide o il diolo) e sono state osservate in generale alte rese ed enantioselettività in assenza di un
cosolvente; l''utilizzo di un cosolvente come CH3CN e THF ha portato a buoni eccessi enantiomerici ma a rese
significativamente più basse (Tabella 6).

Meccanismo della risoluzione cinetico dinamica delle aldeidi arilproprioniche
L''elevata (S)-enantioselettività della riduzione enzimatica in termini di costante cinetica, dimostra che la
velocità di riduzione delle aldeidi (S) (ks) è maggiore delle aldeidi (R) (kR), ma l''efficienza dell''intero processo
è strettamente connessa alla velocità di racemizzazione (kinv).

Noyori 137 ha sviluppato un trattamento quantitativo di un processo DKR tramite un sistema di riduzione accoppiato ad una stereoinversione e ha mostrato che conversioni quantitative e buone enantioselettività
possono ancora essere ottenute quando la costante di velocità della racemizzazione (kinv) e la costante di
velocità di riduzione dell''enantiomero più veloce sono le stesse. Se kinv diventa più lenta di kfast si osserva
un abbassamento nell''eccesso enantiomerico dell''enantiomero preferito ad alte conversioni, ma un buon
processo DKR può essere ancora ottenuto se kinv è più elevata della velocità costante di riduzione
dell''enantiomero che reagisce più lentamente (kinv > kslow). Noi abbiamo osservato in generale una diminuzione nel tempo del rapporto S/R all''aumentare delle rese di
reazione e questo può essere legato ad una kinv più lenta di kS. Inoltre sia la risoluzione che la
racemizzazione sono assolutamente pH dipendenti; in particolare la tautomeria cheto-enolica avviene
tramite trasferimento di protoni. 138 Abbiamo quindi studiato la bioriduzione della 2-fenilpropanale a diversi valori di pH, nel range tra 6-8.5, tenendo conto soprattutto la sensibilità dell''enzima HLADH. Come ci
aspettavamo, le rese sono fortemente influenzate dal pH. A pH 7.5 la resa è stata particolarmente buona, ma
non a pH 8.5. Il risultato potrebbe essere dovuto ad una diminuzione della attività dell''enzima e del legame
con il cofattore ad alti valori di pH. 139 Comunque, l''enantioselettività migliore è stata raggiunta ai valori di pH più elevati. Inoltre la diminuzione percentuale dell''enantimero S aumentando i tempo di reazione e la
conversione, confermano che la velocità di racemizzazione kinv è molto vicina o anche più bassa di KS, in
accordo con l''analisi cinetica di Noyori.
137 a) M. Kitamura, M. Tokunaga and R. Noyori, J. Am. Chem. Soc.,1993, 115, 144''152; (b) J. Andraos, J. Phys. Chem. A, 2003, 107, 2374''2387; (c) J.
Steinreiber, K. Faber and H. Griengl, Chem.''Eur. J., 2008, 14, 8060''8072
138 E. Iglesias, J. Org. Chem., 2003, 68, 2680''2688 139 L. A. LeBrun and B. V. Plapp, Biochemistry, 1999, 38, 12387''12393.
Come già sopra sottilinato, il processo di racemizzazione è particolarmente importante per questo processo
DKR; abbiamo quindi studiato più in dettaglio a racemizzazione della 2-fenil propanale, ibuprofenale e
naprossenale (1a,1b and 1e) enantiomericamente pure (S) in assenza della riduzione entimatica. Abbiamo
osservato la diminuzione della rotazione ottica nel tempo di soluzioni di queste tre aldeidi in tampone
fosfato pH 7.5 e 8.0, 0.1 M in presenza di acetonitrile come cosolvente per assicurare la completa
dissoluzione del susbtrato. Sarebbe stato molto significativo effettuare questo studio tramite HPLC chirale,
ma non è stato possibile trovare condizioni di separazione idonee. Se si assume che la racemizzazione non
sia niente altro che la formazione di un racemo a partire da un enantiomero puro che segue una reazione
irreversibile di ordine 1, deriva che: 140 -ln(at/ao) = Kinvt (1) E: t1/2 = ln 2/Kinv (2) 140 E. J. Ebbers, G. J. A. Ariaans, J. P. M. Houbiers, A. Bruggink and B.Zwanenburg, Tetrahedron, 1997, 53, 9417''9476. In queste formule, at è la rotazione ottica osservata al tempo t, a0 è la rotazione ottica al tempo t=0, t1/2 è il
tempo di dimezzamento e kinv è la costante di racemizzazione.

In accordo all''equazione 1, dovremmo aspettarci una relazione lineare con una pendenza corrispondente ai
valori di Kinv . Nei nostri dati, non è mai stata osservata la linearità durante l''intero esperimento perché
l''aldeide può formare l''idrato chirale e il sottoprodotto achirale chetonico, come è stato osservato tramite
HPLC. Ma comunque nel tempo iniziale si può osservare un range lineare per tutti gli esperimenti e ciò ha
permesso di calcolare i valori di Kinv , che sono poi stati riportati in Tabella 7.
Tabella 7
I tempi di dimezzamento (t1/2) sono invece stati calcolati tramite kinv utilizzando l''equazione 2 e paragonati
poi con quelli osservati (t1/2obs), derivanti della rotazione ottica iniziale (ao/2).
Come ci si aspettava, la racemizzazione risulta particolarmente controllata dal pH per tutte le aldeidi:
all''aumentare del pH aumenta la racemizzazione e diminuisce il tempo di dimezzamento t1/2. La 2-Fenil
Propanale è l''aldeide con la più veloce costante di racemizzazione, mentre sia la ibuprofenale che la
naprossenale hanno delle kinv più basse. Sperimentalmente si osserva che buoni rapporti enantiomerici con
l''ibuprofenale si ottengono in tempo di reazione lunghi, mentre per la naprossenale c''è un grande limite
legato alla sua decomposizione nel corrispondente arilchetone.

2.3.2. Supportazione dell''enzima HLADH
Il punto critico di tale catalisi resta l''impossibilità di recuperate a fine processo l''enzima impiegato. Il
protocollo sintetico prevede infatti di eliminare l''HLADH sospeso in soluzione acquosa, tramite filtrazione,
impedendone il riciclo. Questo svantaggio deriva dalla natura idrofila del catalizzatore che non consente suo
il recupero tramite estrazione.
Un altro svantaggio è la sua sensibilità. Gli enzimi infatti sono macromolecole composte da uno o più siti
attivi e uno ''scheletro'' aminoacidico particolarmente complesso e delicato. Questo li rende particolarmente
instabili in condizioni di stress ambientale come: solventi organici di varia natura, pH e temperatura di
reazione.
Per questi motivi negli anni si sono sviluppate diverse tecniche di immobilizzazione enzimatica su fase solida. In linea di principio un enzima immobilizzato è in genere associato, reversibilmente o irreversibilmente ad un
supporto solido di varia natura. Le scelte della tecnica di immobilizzazione e del supporto sono condizionate
dall''enzima e soprattutto dal tipo di processo che esso dovrà svolgere. L''uso di una tecnica di supportazione
inadatta può portare alla completa denaturazione dell''enzima, a modificare la struttura conformazionale di
uno o più siti attivi presenti, oppure, nel caso vengano utilizzate condizioni di reazione particolari, il suo
completo distacco dal supporto. Quest''ultimo problema, sebbene non comprometta irreversibilmente la
funzionalità del catalizzatore, ne impedisce il recupero e quindi il riciclo.
Non esiste una tecnica di immobilizzazione che non comprometta anche minimamente l''attività dell''enzima;
per questo motivo è bene scegliere quella che più si adatta al tipo di enzima per cui verrà impiegata. In
generale, l''immobilizzazione dovrebbe agire sotto diversi punti di vista.
- aumentare la stabilità dell''enzima, cioè portare la proteina ad essere più stabile rispetto allo stato libero ed
essere in grado di sopportare condizioni di reazione più forti;
- permettere il riciclo dell''enzima;
- facile separazione dalla miscela di reazione;
- modulazione delle proprietà catalitiche;
- prevenzione migliore da contaminazioni proteiche (proteasi) e microbiche.

Tecniche di immobilizzazione
Le tecniche di immobilizzazione enzimatica possono essere suddivise in due grandi classi, in base al tipo di
interazione enzima-supporto:
1- intrappolamento
2-coupling

Intrappolamento
Questa tecnica consente di intrappolare l''enzima in un supporto solido senza che avvenga tra i due una
interazione di tipo chimico. In questo modo l''enzima risulta confinato in uno spazio tridimensionale senza
essere fisicamente modificato, consentendogli di mantenere inalterata la propria struttura conformazionale.
La natura del supporto deve impedire la fuoriuscita dell''enzima ma al contempo consentire il passaggio sia
del substrato, che del cofattore. L''intrappolamento può avvenire all''interno di una matrice di tipo polimerico
o micellare oppure in membrane o fibre.

Coupling
Diversamente da quanto visto precedentemente, nel caso di coupling l''enzima viene attaccato fisicamente
ad un supporto (carrier), oppure interconnesso attraverso cross-linking agli altri enzimi. Le tecniche di
coupling, nei casi in cui avvengano tramite legame covalente, bloccano l''enzima rendendo la supportazione
più stabile rispetto ai metodi di intrappolamento, permettendo di operare in condizioni di stress ambientale
maggiori (agitazione meccanica, solventi organici, temperature elevate, ecc). Lo svantaggio maggiore
nell''uso di questa tecnica è che la supportazione avviene tramite reazioni chimiche, spesso aggressive per
l''enzima. Questo si traduce spesso in una sua perdita di attività.
Immobilizzazione dell''enzima HLADH: tentativi e successo 141 Grazie ad una collaborazione con il gruppo di ricerca di Francesca Paradisi all''UCD di Dublino e un periodo
del mio dottorato che ho trascorso presso il loro dipartimento ho potuto studiare e realizzare una
metodologia di supportazione dell''enzima HLADH. Sono state tentate ma senza successo strategie di
immobilizzazione per intrappolamento su sfere di idrogel di chitosano e di idrogel di alginato. Si è quindi
passati a immobilizzare l''enzima con metodologie di natura covalente, provando a legare la proteina alla
silice o di nuovo al chitosano, ma anche in questo caso senza successo. E'' stata tentata un''altra metodologia
covalente utilizzando biglie di vetro che per la prima volta ha portato alla supportazione dell''enzima. 141 F. Paradisi, P. Galletti, D. Quaglia, M. Pori, D. Giacomini, ''Engineered Horse Liver Alcohol Dehydrogenase: Immobilization and Application in the
Enantioselective Synthesis of (S)- Arylpropanols', ASAP to Process Biochem, 2013 Le biglie di vetro offrono diversi vantaggi in qualità di supporto, quali la stabilità termica e meccanica, la
mancanza di tossicità verso le sostanze biologiche e una forte resistenza nei confronti di solventi organici e di
agenti microbiologici.

Il processo di supportazione prevede una procedura necessaria di attivazione e derivatizzazione della biglia
seguendo questo schema:
- attivazione della superficie delle biglia con un forte trattamente acido/base e ossidante;
- derivatizzazione con uno spaziatore opportuno che permetta alla biglia di legare più enzimi;
- formazione del legame tra enzima e biglia di vetro.
La scelta della dimensione delle biglie di vetro è ricaduta su quelle del diametro di 425-600 μm, dimensioni
sufficienti per ottenere un buona superficie di contatto enzima-supporto ed al contempo rendere semplici le
operazioni di supporto e di recupero dall''ambiente di reazione.
Il processo studiato ha visto quindi l''attivazione della superficie vetrosa delle sferette tramite un lavaggio
acido che ha permesso di liberare gruppi OH 142,143, consentendo in questo modo di legare covalentemente un linker aminico (γ-APTES) alla superficie. Per favorire l''attacco dell''enzima, inoltre, si è allungato lo
spaziatore, tramite l''aggiunta di anidride succinica. Le biglie così derivatizzate sono state fatte reagire con
l''enzima, attraverso un secondo legame amidico 144,145.
Lo step più importante in tutto questo processo è sicuramente l''ultimo, ovvero, l''attacco HLADH alla
superficie vetrosa derivatizzata. E'' noto in letteratura che l''eccessiva immobilizzazione della superficie
enzimatica, attraverso numerosi legami covalenti, può portare all''alterazione della sua struttura,
disattivando completamente i siti attivi all''interno dell''enzima. Per evitare ciò sono state studiate e
ottimizzate con cura le condizioni migliori, tra cui appunto il pH, la temperatura e sopravere per essere attive
come antibiotici: 142 Food Chemistry 104 (2007) 1385-1392;
143 Bull. Korean Chem. Soc. (2006), 27, 4;
144 Synthetic Comm. 36, (2006), 3591-3597; 145 Enzyme and microbial technology 39 (2006), 1016-1022; attutto le opportune quantità di EDC e di enzima da utilizzare.





Il pH e la temperatura di reazione condizionano sia l''enzima che la carbodiimmide. E'' noto in letteratura che
la reattività dell''EDC è legata all''acidità dell''ambiente di reazione 146. Per questo motivo il suo attacco alle funzioni carbossiliche è stato eseguito a pH 5.0, mentre il coupling ammidico dell''enzima a pH 8.0.
Le migliori condizioni relative all''entry 2 mostrano come tutti l''enzima sia supportato e che l''attività specifica
sia però diminuita al 20%; la diminuzione dell''attività specifica per opera della supportazione è però peraltro
un fenomeno noto.
Le biglie supportate venivano poi conservate a 4°C in un tampone fosfato a pH 7.5 0.1 M e l''attività specifica
valutata tramite la velocità di ossidazione dell''etanolo ad acetaldeide. Dopo ogni ciclo catalitico le biglie
venivano accuratamente e delicatamente lavate con tampone fosfato e ci si rimetteva nelle condizioni di
studiare il ciclo successivo.
L''attività dell''enzima comunque si annullava del tutto dopo 6 cicli catalitici e ciò poteva essere imputato alla
degradazione dell''enzima o ad un suo progressivo distaccamento dalla superficie vetrosa. Tale
comportamento può essere imputato anche allo stesso γ-APTES. La molecola non derivatizzata tende a
perdere metanolo nel tempo in acqua in funzione del pH e della temperatura. 147
Le modalità di conservazione dell''enzima (4°, pH 7.5) non sembrano provocare problemi alla sua stabilità.
Ma la verifica dell''attività nei confronti dell''etanolo, essendo svolta a pH 8.8 e a 25° potrebbero molto
facilmente causare progressivamenre l''idrolisi del silicio con il conseguente distacco dell''enzima dalla biglia.

Tutti i risultati positivi riguardanti i Profeni ottenuti in precedenza ci hanno spinto a dirigere la ricerca verso
la produzione di un nuovo enzima HLADH modificato in maniera opportuna con l''obiettivo di facilitare il
processo di supportazione e quello di purificazione. In particolare il gruppo di ricerca di Francesca Paradisi,
ha deciso di ingegnerizzare il gene che codifica per la subunità E, essendo la sequenza del DNA nota e
disponibile grazie al lavoro del professor Plapp 148 ed essendo questa subunità E la più specifica per l''ossidazione/riduzione degli alcoli primari 149. La modifica che si è voluta apportare è relativa all''inserimento di 6 istidine aggiuntive sulla parte N-terminale della subunità. Questa modifica è ben nota in ambito
biotecnologico ed viene effettuato perché i 6 imidazoli delle 6 istidine adiacenti offrono molti vantaggi. E''
importante sottolineare che prima aver proceduto al processo di supportazione è stato necessario stabilire
un protocollo affrontando nell''ordine tre diversi step:
- produzione dell''enzima;
- purificazione dell''enzima; 146 Uptima FT-UP52005
147 Unep Publications, ID 919-30-2, DATE 08.03.2004 148 Park D., Plapp, B., J. Biol. Chem., 1991, 266, 13296-13302
149 Quaglia, D., Irwin, J. A., Paradisi, F., Mol. Biotechnol., 2012, 52, 244-250. caso biglie di vetro (mg) EDC (mg) HLADH (mg) T (°C) tampone (pH) HLADH supportato (%) SA (%) 1 350 2,6 0,038 4 5 99,8 1,32 2 396 4 0,0853 25 5 98,6 20,1 - caratterizzazione dell''enzima (His-HLADH-EE) e verifica della sua attibità paragonandolo con l''analogo privo
delle istidine (HLADH-EE).

La produzione:
L''enzima è stato prodotto trasformando un ceppo di E. Coli che è stato dopo fatto crescere e proliferare per
15-20 ore in un bioreattore 37°C agitando agitando per 250 giri al minuto. A crescita ultimata le cellule sono
state trattate con lisozima (da uovo) e accuratamente sonicate a 0° per lisarle completamente; dopodichè si
è proceduto alla centrifugazione e successivamente alla filtrazione. Prima di procedere allo step di
purificazione della proteina, ci si è assicurati che il lisato stesso avesse l''attività di una deidrogenasi. La
verifica dell''attività del Lisato è cruciale per poter procedere, per due motivi: in primo luogo il batterio
potrebbe non aver assorbito il DNA e quindi non aver prodotto la proteina; in secondo luogo, la proteina
potrebbe essere stata prodotta ma la modifica della catena peptidica potrebbe aver minato la sua attività.

La purificazione:
La purificazione è stata effettuata in un singolo tramite cromatografia per affinità metallica su di una colonna
6B -Sepharose-IMAC pretrattata NiSO4.

Questa colonna possiede una struttura polimerica e polisaccaridica di sefarosio (Separation-Pharmacia-
Agarose) cui sono legate molecole di acido imino diacetico (IMAC), forti complessanti per metalli.
Pretrattando la colonna con Nichel si osserva la sua progressiva colorazione in blu per la formazione del
complesso sopra rappresentato. Quando il lisato batterico viene eluito lungo la colonna, solo la proteina
derivatizzata con le 6 istidine (His-HLADH-EE) viene legata, tramite la formazione di un complesso tra il nickel
e i 6 imidazoli, mentre tutto il resto eluisce indisturbato.
Per ''sganciare' la proteina dalla colonna si eluisce una soluzione di EDTA, consapevolmente al fatto che la
molecola ha noti effetti inibitori nei confronti delle deidrogenasi zinco-dipendenti, probabilmente per la
capacità di complessare il metallo e rimuoverlo. La soluzione di His-HLADH-EE dopo l''uscita dalla colonna
conserva la sua attività ma viene comunque rimosso l''EDTA tramite un processo di dialisi, in cui la si
sostuisce con un tampone fosfato a pH 7.5. Tramite elettroforesi si osserva l''effettiva efficacia della purificazione della proteina (corsa centrale)
soprattutto se confrontata con il lisato (corsa a destra), che appare con una banda sola dal peso molecolare
approssimativo di 42-44 KD (come ci si aspetta per la subunità E) per paragone con il riferimento del peso N OH O OH O N O O HO HO Ni2+ NiSO 4 molecolare (corsa a sinistra). Tramite esperimenti di cromatografia ad esclusione di massa è stato
dimostrato che la deidrogenasi mantiene la forma dimerica e quindi pare che la presenza delle 6 istidine non
influisca sulla struttura quaternaria.

Caratterizzazione e attività dell''enzima
Il nuovo enzima è stato valutato per quanto riguarda la sua attività a diversi pH e a diverse temperature,
paragonandolo all''enzima analogo ma privo delle istidine. L''attività calcolata, in particolare, è stata calcolata
nei valutando l''ossidazione dell''etanolo ad acetaldeide. Entrambi gli enzimi mostrano un tipico profilo di
attività a campana in funzione del pH, ma in particolare l''enzima His-HLADH ha un pH optimum a 8.8, quasi
un''unità di differenza in meno rispetto all''enzima libero.

Per quanto riguarda la temperatura, entrambi gli enzimi hanno osservato un aumento dell''attività
all''aumentare della temperatura fino a 60°.

Immobilizzazione dell''enzima His-HLADH-EE
Sono stati effettuati quindi studi di immobilizzazione di questo enzima modificato sfruttando le
caratteristiche indotte dalla presenza delle 6 istidine.

Resine StratoSphere:
Questo tipo di resine consiste in polimeri di polistirene che possiedono diversi gruppi funzionali sulle
estremità.
N C O O N H CH3 O O NH2 CH3 n O OH O CHO PL-NCO PL-PEGA PL-WANG PL-CHO Queste resine sono disponibili commercialmente a diversi gradi di reticolazione polimerica, caratteristica che
consente il rigonfiamento o meno in presenza di solventi apolari quali idrocarburi. La reticolazione della
resina e la sua natura polimerica conferiscono al supporto un certo grado di resistenza agli urti meccanici,
mentre la struttura polistirenica ne consente l''utilizzo in solventi polari e/o acqua senza alcun tipo di
degradazione chimica. Quest''ultimo aspetto è di importanza fondamentale, in quanto la proteina supportata
sulla resina deve essere conservata (se non liofilizzata) in una soluzione tampone per conservarne l''attività
catalitica e prevenire quindi la denaturazione. Un ulteriore vantaggio nell''utilizzo di queste resine è che per
loro è noto il dato corrispondente al numero di mmoli presenti, aspetto che facilita il corretto dosaggio dei
reagenti chimici necessari per una corretta derivatizzazione.

Prendendo come modello l''interazione fase stazionaria-metallo-proteina sfruttata nella cromatografia ad
affinità metallica abbiamo modificato le resine derivatizzandole con metalli per realizzare la supportazione
della His-Tag HLADH. In particolare ci siamo focalizzati su un particolare tipo di resine Stratosphere, le PL-
EDA (Ethylene diamino).
Figura 5



Questo tipo di resina è noto in letteratura per le sue proprietà di ''scavenger' 150 per i metalli, ovvero per la capacità di legare ioni metallici in soluzione eliminandoli quindi dal mezzo.
Il nostro obiettivo era quello di realizzare un complesso metallo-resina e poi legare la proteina a questo
supporto. Il metallo scelto per formare il legame con la resina è stato il Nickel; abbiamo però esteso la
ricerca provando ad utilizzare il anche il Cobalto e il Rame. Per quanto riguarda il cobalto è nota la sua
capacità di interagire con la coda di istidine ed è a volte utilizzato al posto del nickel nei processi di
purificazione; il rame è stato scelto per affinità al nickel in quanto è l''elemento successivo nella tavola
periodica.
La sintesi della resina è stata effettuata mettendo a reagire la resina con soluzioni saline dei tre metalli.
150 Gokak, D. T., Kamath, B.V., Ram, R.N., J. Appl. Polym. Sci., 1988, 35, 1523-1535 N H NH2 CoCl2 NiCl2 CuSO4 N Cu2+ NH N Ni2+ NH N Co2+ NH violetto verde chiaro blu GIALLA-VERDE BLU-VERDE BLU ELETTRICO PL-EDA Stratosphere (R)
Le resine sintetizzate venivano poi accuratamente lavate in modo da eliminare il più possibile ogni traccia di
metallo non legato.
Per fortificare il legame della resina al metallo abbiamo sintetizzato un''altra tipologia di resine; quello che
abbiamo fatto è stato legare l''aldeide salicilica alla resina tramite un legame imminico.
N H NH2 NH N PL-EDA Stratosphere (R) OH O N N Mn+ GIALLA VIVA HO O
Il legame ulteriore al metallo proviene dall''OH fenolico.
LA proteina HIS-HLADH-EE è stata messa a contatto con le resine ed è stata valutata la quantità effettiva di
resina legate e l''attività della resina al primo ciclo. La valutazione della quantità di proteina legata è stata
calcolata misurando tramite il test di Bradford l''ammontare di proteina non legata rimasta in soluzione; il
valore ottenuto è stato poi sottratto dalla quantità di proteina iniziale nota. L''attività è stata misurata nel
modo consueto misurando la velocità di ossidazione dell''etanolo (Tabella 8).
Tabella 8
Tutte le resine ad eccezione del cobalto sono state in grado di legare la proteina con delle percentuali
variabili, ma unicamente la resina al Nickel ha mostrato un certo grado di attività al primo ciclo. Tuttavia
l''attività della resina al secondo ciclo di reazione è risultata essere nulla. Dai test di Bradford della soluzione
in cui è stata valutata la reattività del primo ciclo di reazione è risultato esserci un quantitativo di proteina molto simile alla percentuale di enzima legato. La proteina quindi si è staccata dalla resina pur conservando
l''attività. Il motivo del distacco può essere la presenza di un legame non covalente tra la proteina e la resina,
oppure il pH del saggio cinetico (8.8) può aver causato la formazione di specie Ni(OH)X che hanno provocato
la scissione del legame.
Questo risultato negativo ci ha spinto a cercare in letteratura una metodologia più robusta per portare alla
formazione di un legame covalente tra l''enzima e la resina. In particolare abbiamo diretto il nostro interesse
verso l''utilizzo di una resina epossidica, un supporto largamente utilizzato nell''ambito
dell''immobilizzazione. 151 La strategia utilizzata e su cui ci siamo basati prevede proprio la supportazione di un enzima in cui è presente un ''tag' di istidine e porta alla fine alla formazione di un legame covalente tra
l''enzima e la resina. La procedura prevede in primo luogo il trattamento della resina epossidica (Sepabeads
EC-EP/S, Resindion, Milan) con acido imminodiacetico con lo scopo di far reagire il 5% degli epossidi sulla
superficie e successivamente la complessazione con uno ione metallico. A questo punto si mette a contatto
l''enzima His-HLADH-EE con la resina con l''obiettivo di creare una complessazione con il metallo da parte
delle istidine; l''enzima così complessato reagisce, tramite i residui nucleofili degli amminoacidi presenti sulla
superficie (Lys, Cys, Tyr o Ser), con i residui epossidici che non hanno reagito per portare alla formazione di
legami covalenti. Si procede dopo alla rimozione dello ione metallico con EDTA e si tratta infine la resina con glicina per ''cappare' i gruppi epossidici che non hanno reagito.
Strategia di immobilizzazione dll''enzima HLADH-EE usando la resina epossidica (in grigio) derivatizzata con IDA Osservando l''efficacia della procedura di immobilizzazione, si è proceduto allo studio della sua
ottimizzazione, da molti punti di vista. In primo luogo si è proceduto a verificare il ruolo del metallo nei
confronti dell''attività dell''enzima supportato paragonandolo a quello libero. Si è osservato che l''attività
dell''enzima era molto sensibile sia al tipo di metallo che al numero di siti derivatizzati dallo stesso metallo.
Invece in assenza di trattamento della resina con il metallo, l''immobilizzazione era solo parziale e la
percentuale di attività ritenuta solo del 40%.

151 a) C. Mateo, G. Fernández-Lorente, E. Cortés, J. L. Garcia, R. Fernández-Lafuente and J. M. Guisan, Biotechnol. Bioeng., 2001, 76, 269-276; b) B. C.
C. Pessela, C. Mateo, A. V. Carrascosa, A. Vian, J. L. García, G. Rivas, C. Alfonso, J. M. Guisan and R. Fernández-Lafuente, Biomacromolecules, 2003, 4,
107-113; c) J. M. Guisan, Immobilization of enzymes and cells, Humana Press, Totowa, 2006 0 20 40 60 80 100 % a c ti v it y free
enzyme immobilized no
metal Co Cu Ni a) 0 20 40 60 80 100 % a ct ivi ty control Co Ni Cu b)

















a) Attività dell''enzima immobilizzato His-HLADH-EE quando differenti ioni metallici (oppure no) vengono usati per il processo di immobilizzazione.
L''attività del 100% è stata osservata per l''enzima libero prima dell''immobilizzazione; b) Studio della inattivazione dell''enzima His-HLADH-EE per opera
dello stesso metallo stato per l''immobilizzazione paragonato all''enzima senza metalli.
La derivatizzazione con il cobalto (utilizzando CoCl2) ha portato l''enzima His-HLADH-EE a ritenere il 65% della
sua attività originale. Utilizzando gli altri metalli l''enzima aveva un''attività ancora più bassa; 58% per il Nickel
e 22% per il Rame. Come si sa la supportazione è causa della diminuzione dell''attività dell''enzima ma per
verificare se anche il metallo avesse un effetto tossico sulla proteina è stata valutata l''inattivazione in
presenza dei metalli utilizzati liberi in soluzione. Si è quindi proceduto aggiungendo soluzioni dei metalli
utilizzati (Co 2+, Ni2+ e Cu2+) all''enzima libero e si è velocemente valutata l''attività paragonandola a quella dell''enzima senza alcuna aggiunta. Con il cobalto si ha avuto una ritenzione del 96% dell''attività, con il nickel
dell''83% mentre con il rame si è osservata la completa e immediata perdita di attività dell''enzima. I risultati
sembrano essere in buon accordo con quelli relativi alla percentuale di ritenzione rilevata sulle resine e
sembra quindi che il cobalto porti al migliore risultato in termini di capacità si supportare l''enzima oltre che a
risultare anche il meno tossico. Per ottimizzare ulteriormente il processo di supportazione/purificazione
abbiamo deciso di effettuare direttamente la reazione di immobilizzazione sul lisato batterico, sfruttando la
capacità della resina derivatizzata al cobalto di legarsi esclusivamente con il residuo di sei istidine della His-
HLADH-EE. Il risultato è stato molto positivo, portando alla supportazione dell''enzima e ad una considerevole
ritenzione dell''attività, che si attesta attorno al 60% se confrontata all''enzima libero.
L''ultimo aspetto che è stato studiato è stato l''aumento progressivo di enzima caricato sulla resina epossidica
(da 1 a 5 mg di enzima) mantenendo costante la quantità di cobalto e resina (1 g di resina). In particolare si è
osservato che l''aumento dell''attività dell''enzima non era proporzionale alla quantità di enzima utilizzato e
che oltre i 2 mg di resina caricata si osservava perdita di attività.

Caratterizzazione dell''enzima
Dopo aver studiato l''ottimizzazione, ci siamo dedicati alla caratterizzazione dell''enzima supportato (s-His-
HLADH-EE).
In primo luogo abbiamo voluto verificare la morfologia della resina epossidica tramite microscopia a
scansione elettronica (SEM-EDS) prima e dopo la derivatizzazione per investigare possibili cambiamenti sulla
superficie e/o fenomeni di aggregazione. Tali fenomeni possono alla lunga minare l''attività della resina, oltre
che diminuire in effetti la superficie accessibile al solvente. Dalle analisi si osserva che le biglie supportate
hanno una dimensione che va tra i 100 e i 300 nm e mantengono una dimensione sferica. Risultano tutte
individualmente separate e non si osservano fortunatamente fenomeni di aggregazione. Sia il campione b
che il campione c non mostrano la presenza di cobalto, confermata dalla assenza della linea di assorbimento
specifica a 6.92 keV e k 7.65 keV. Il cobalto è invece stato trovato come previsto sul campione d dove infatti
sono state trovate le linee di assorbimento specifico k.
0.5 mm
50 m a) b) 0.5 m c) 0.5 m 0.5 m d)



















SEM delle resine: a) con His-HLADH-EE; b) con His-HLADH-EE ad un migliore ingrandimento; c) pretrattamento con IDA; d) dopo il trattamento con
Co 2+
Si è poi proceduto alla caratterizzazione dell''enzima supportato paragonandolo a quello libero in funzione
dei seguenti parametri: pH, temperatura, stabilità nel tempo, riciclo e attività in miscela di solventi organici.
















a) Screening per la ricerca dell''ph ''Optimum' per l''enzima libero His-HLADH-EE e tra 6.5 e 12.5 tramite l''ossidazione dell''etanolo.
Il pH e la temperatura sono stati studiati con l''obiettivo di caratterizzare l''enzima ma soprattutto di
determinare i parametri migliori per la biocatalisi. E'' però importante ricordare che lo studio dell''attività
dell''enzima in funzione di questi parametri è stato valutato studiando la velocità di ossidazione dell''etanolo.
L''attività in funzione del pH è stato studiato tra 6.5 e 12.5, osservando che l''enzima supportato mostrava,
come ci si aspettava, la tipica curva a campana ma con uno shift inaspettato di attività a pH 9.5, un''unità di
pH più alto dell''enzima libero. L''enzima supportato sembra quindi mostrare l''attività migliore a pH più
alcalini.
a















Screening di attività a diverse temperature (25-55°C).
E'' stato poi valutato l''effetto della temperatura sull''attività enzima tra i 25°C e i 55°C. Entrambi gli enzimi
sembrano migliorare la loro attività linearmente anche se sicuramente l''enzima libero mostra un incremento
più marcato. Oltre i 55°C non è più stato possibile effettuare alcuna misura a causa della impossibilità di
effettuare misure UV, probabilmente a causa dell''evaporazione dell''etanolo e/o all''inattivazione dell''enzima.

Per verificare la stabilità dell''enzima nel tempo, l''enzima libero e immobilizzato sono stati conservati a 37°
per 160 ore a due dfferenti pH, 8.5 e 6.5. Si è osservato che entrambi gli enzimi a pH 8.5 risultavano ancora
essere attivi dopo 160, mentre a pH 6.5 l''enzima immobilizzato ha mostrato la migliore stabilità dove invece
l''enzima libero aveva perso il 50% di attività già dopo 15 ore. L''enzima supportato comunque viene
conservato a 4°C dove dopo 2 mesi si osserva ancora una attività identica, che è come detto in precedenza il
60% rispetto a quella dell''enzima libero.
La verifica della riciclabilità dell''enzima supportato è stata effettuata monitorando il numero di cicli di
ossidazione dell''etanolo che era in grado di portare a termine.

Riciclabilità di un campione immobilizzato di His-HLADH-EE in 10 cicli ossidativi (l''attività di ogni ciclo è stata monitorata per 9 minuti). L''apparente
caduta dell''attività è dovuta alla perdita sperimentale di resina durante l''esperimento.

Dopo ogni ciclo catalitico completato, la resina veniva accuratamente e dlicatamente lavata per prepararla al
ciclo successivo. Anche dopo 10 cicli catalitici, utilizzando lo stesso campione di enzima immobilizzato,
l''attività specifica dell''enzima rimaneva virtualmente identica. Dal grafico si nota in effetti una diminuzione
ma il dato è attribuibile alla perdita naturale di resina durante le procedure che portano alla misurazione
dell''attività (lavaggio della cuvetta, aderenza alle punte di plastica delle gilson). Questo risultato è molto
significativo perché permette il recupero dell''enzima ed è sostanzialmente l''obiettivo della supportazione 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S .A . (U /m g ) cycles b enzimatica. Successivamente è stata anche studiata la riciclabilità dell''enzima nelle condizioni di bioriduzione
enantioselettiva delle aldeidi 2-aril propioniche, con risultati significativi.

E'' noto come gli enzimi possano esprimere attività catalitica anche in solventi organici. 152 Spesso l''uso di un solvente organico in biocatalisi è fondamentale soprattutto per favorire la solubilizzazione del substrato che
deve essere trasformato; in aggiunta il solvente organico può in alcuni casi alterare le proprietà dell''enzima a
volte in maniera inaspettata. Risulta quindi molto importante valutare la tolleranza dell''enzima libero e
supportato ai solventi organici utilizzando in particolare piccole quantità di cosolventi quali l''CH3CN, il THF, il
DMSO e il MeOH. Può sembrare strano l''utilizzo del metanolo con una deidrogenasi come la HLADH, ma è
avvalorato che questo alcol non è susbtrato per l''HLADH, e può quindi essere considerato a tutti gli effetti un
solvente. 153 Il comportamento e l''attività dell''enzima libero e supportato sono stati valutati in presenza del 10% e del 20% di solvente e confrontati con il comportamento in un tampone di Tris a pH = 8.5, 50 mM al
tempo zero e dopo 24 ore.
Stabilità dell''enzima in diversi solventi al 10% e al 20% e Tris-HCl 50 mMolare, a pH 8.5
Il risultato generale è che l''enzima supportato sembra tollerare molto bene i cosolventi organici rispetto
all''enzima libero, aspetto che dimostri come la supportazione porti in generale ad un effetto stabilizzante. Si
osserva che l''enzima libero tollera bene il 10% di MeCN ma al 20% si assiste a una significativa perdita di
attività dopo 24 ore; l'enzima supportato invece risulta più attivo. E'' molto interessante notare che anche in
THF, MeOH e DMSO l''enzima supportato in presenza del 20% di questi solventi risulta molto più stabile
dell''enzima libero; in particolare poi in DMSO l''enzima libero non è attivo.
Dopo aver caratterizzato completamente l''enzima supportato abbiamo deciso di andare oltre e verificare la
sua attività nel compiere la reazione di bioriduzione enantioselettiva delle aldeidi 2-arilpropioniche per
ottenere gli S 2 arilpropanoli, i precursori degli (S)-Profeni.
Lo studio è stato inizialmente fatto sulla 2-fenil propanale, aldeide considerata modello per tutte le altre
aldeidi 2-aril propioniche: abbiamo studiato l''effetto della quantità di enzima supportato utilizzata e del pH
sulle rese di reazione, utilizzando le condizioni di partenza migliori che sappiamo fornire i migliori dati di
eccesso enantiomerico e resa per l''enzima HLADH. Le rese sono state valutate tramite retta di calibrazione.
152 a) A. Klibanov, Nature, 2001, 409, 241-246; G. Carrea and S. Riva, Angew. Chem. Int. Ed., 2000, 39, 2226-2254 153 a) C. Wratten and W. W. Cleland, Biochemistry, 1965, 4, 2442-2451; b) F. M. Dickinson and K. Dalziel, Nature, 1967, 214, 31-33; c) H. Sund and H
Theorell, in The Enzymes, Academic Press, New York, 1963, vol. 7, pp. 25-83; d) J. B. Jones and H. M. Schwartz, Can. J. Chem., 1982, 60, 1031 free His-HLADH
immobilized His-HLADH
Buffer CH3CN THF DMSO MeOH 10% 20% 20% 20% 20% 20% 20% 20% 20% 10% 10% 10% supp-HIS-HLADH-EE buffer / organic solvent (R,S) O H OH O NADH NAD+ OH
La prova effettuata in tampone fosfato a pH 7.5 con il 10% di MeCN come cosolvente (l''acetonitrile, si
ricorda, sembra essere il solvente migliore per l''enzima supportato) ha portato a rese quasi quantitative in
alcol; l''aumento del pH fino a 8.5 porta progressivamente alla diminuzione della resa in alcol, forse per
l''intervento di fenomeni di autocondensazione aldolica catalizzate dal pH basico. E'' interessante notare
come lo spostamento del pH di reazione verso quello in cui l''attività (verificata nella reazione di ossidazione
dell''etanolo) dell''enzima supportato è migliore, cioè 9.5, non porta complessivamente ad un miglioramento
ma va in direzione opposta.
Anche in questo caso si osserva il verificarsi della risoluzione cinetico dinamica, essendo la resa di reazione
molto maggiore del 50% (aspetto che esclude la semplice risoluzione cinetica). Successivamente abbiamo
studiato gli effetti dovuti alla quantità di enzima utilizzato: a parità di quantitativo di aldeide sono state
testate 3 aliquote differenti di enzima: 500, 50 e 25 mg di enzima immobilizzato His-HLADH-EE (che
corrispondono a 0.4, 0.04 e 0.02 unità in accordo ai risultati calcolati per l''enzima. Il miglior risultato è stato
ottenuto con 50 mg di enzima; con 25 mg la reazione è stata più lenta mentre la prova con 500 mg,
soprendentemente, ha portato ai risultati peggiori. Questo dato può essere legato ad un potenziale
''adsorbimento' e/o reattività dell''aldeide con la resina, che porta il substrato carbonilico ad essere
progressivamente consumato e sottratto dalla soluzione. Infine è stato valutato l''utilizzo di isopropanolo
come cosubstrato al posto dell''etanolo per il riciclo del NADH.
Influenza del pH e della quantità di enzima sulla riduzione enzimatica di 1a (0.5 mM) a dare 2a usando l''enzima immobilizzato His-HLADH-EE in 5 mL
di un tampone fosfato a pH 7.5 e al CH3CN di 10% con NADH catalitico. ,', , , ' utilizzando etanolo come cosubstrrato; '': a pH 7.5 con 50 mg di
enzima, isopropanol come substrato.

L''utilizzo dell''isopropanolo è stato pensato perché il prodotto di ossidazione, cioè l''acetone risulta
sicuramente meno tossico dell''acetaldeide nei confronti dell''enzima; tuttavia si è avuto esito negativo
probabilmente perche'' non riesce a lavorare su alcooli secondari..
Dopo questo screening iniziale ci siamo rivolti alla applicazione di s-His-HLADH-EE nella bioriduzione della
naprossenale e della ibuprofenale, paragonandola a quella dell''enzima libero His-HLADH-EE e valutando 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 2 a , Y % time (h) pH 7.5, enzyme 50 mg pH 8, enzyme 50 mg pH 8.5, enzyme 50 mg pH 7.5, enzyme25 mg pH 7.5, enzyme 500 mg iPrOH as cosubstrate anche l''enantioselettività. In tutti questi esempi sono state utilizzate le condizioni migliori di reazioni in
termini di pH, temperatura, cosolvente, concentrazione di susbtrato (come osservato dal predente
screening).
L''utilizzo dell''enzima His-HLADH-EE in una miscela al 10% di CH3CN in tampone fosfato come solvente, ha
portato a rese eccellenti per la 2-fenil propanale e naprossenale e più basse per l''ibuprofenale (Tabella 9). Lo
stesso trend è stato osservato con l''enzima immobilizzato His-HLADH-EE, dove si è osservato un
rallentamento nella velocità di reazione e non si è ottenuta una resa quantitativa a causa della formazione
dei noti sottoprodotti arilchetonici, tipici ''derivati' delle aldeidi 2-aril propioniche. Sia l''utilizzo dell''enzima
immobilizzato che libero hanno mostrato una enantioselettività totale verso la configurazione S e non sono
state trovate mai tracce dell''R. Questo aspetto sembra peculiare dell''enzima His-HLAD-EE, perchè con
l''enzima commerciale HLADH sono stati ottenuti rapporti enantiomerici peggiori fortementi dipendenti dalla
natura del cosolvente. Questo può dipendere dalla presenza delle istidine, che in qualche modo possono
alterare la stereospecifità nei confronti del susbtrato; ma è altrettanto vero che ci può essere anche un
effetto opposto, che porta la proteina ad essere meno specifica e in altri casi anche meno stabile. Studi
recenti messi a punto su due lipasi in cui era stata inserita un ''tag' di istidine sul residuo terminale, hanno
mostrato come il potere catalitico fosse in effetti inalterato mentre risultava profondamente modificata la
stereoselettività e l''enantioselettività. 154. Una possibile spiegazione è che la coda di istidine possa in qualche modo modificare la flessibilità dell''enzima e di conseguenza renderlo più enantioselettivo. Un''altra
spiegazione che potrebbe giustificare la migliore enantioselettività, parte dall''ipotesi che la coda di istidine
non abbia nessun ruolo: come si ricorda la struttura quaternaria della nostra proteina clonata è fatta solo di
subunità E (subunità affine e specifica per alcoli primari e aldeidi), mentre l''enzima commerciale è una
miscela ES. Questo significa che per la reazione utilizziamo un catalizzatore più specifico rispetto a quello
commerciale e questo potrebbe bastare per spiegare il risultato ottenuto.
Tabella 9 Ent. Ald. enzyme solvent 2h 4h Y% 18h
final yield
(time, h) (S/R) 1 1a free CH3CN 10% 56 74 90 100 (42) >99/1 2 1b free CH3CN 10% 33 39 64 61 (42) >99/1 3 1e free CH3CN 10% 56 65 92 100 (66) >99/1 4 1a immobilized CH3CN 10% 46 53 77 88 (42) >99/1 154 Studier, FW. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expres Purif 2005; 41:207-234 5 1b immobilized CH3CN 10% 18 21 37 34 (92) >99/1 6 1e immobilized CH3CN 10% 16 20 63 79 (42) >99/1 7 1a (5mM) immobilized MTBE 50% 3 6 54 82 (42) >99/1 8 1a (5mM) immobilized Hexane 50% 10 10 39 84 (72) >99/1 Attività dell''enzima libero e immobilizzato His-HLADH-EE sulle aldeidi 1a, 1b e 1e. Condizioni: aldeide 0.5 mMolare (entries 1 to 6), NADH 0.01 mM,
EtOH 0.5 M, tampone fosfato 0.1 M pH 7.5, 27°C, V = 5 mL, quantità di enzima 50 mg.

Per studiare ulteriormente i vantaggi relativi all''immobilizzazione dell''enzima, abbiamo utilizzato in sistema
bifasico utilizzando tert-butilmeti etere (MTBE) ed esano per la riduzione della 2-fenil propanale ma a
concentrazioni più alte di essa. Abbiamo osservato che la reazione procede con successo, con valori di resa
simili e anche in questo caso completa enantioselettività. Se la stessa reazione viene fatta alla stessa
concentrazione di aldeide ma non in un sistema bifasico, la reazione si blocca velocemente e l''enzima
supportato appare denaturato.
Abbiamo voluto poi studiare la riciclabilità dell''enzima immobilizzato testandolo nella riduzione di una
soluzione 0.5 mMolare di aldeide in acetonitrile al 10%. Questo esperimento di riciclabilità deve essere
confrontato e associato allo stesso studio fatto quando si è guardata la reazione di ossidazione dell''etanolo
ad acetaldeide nel paragrafo.
Riciclabilità di un campione di enzima immobilizzato His-HLADH-EE sulla riduzione enzimatica di 1a a 2a.
Dopo ogni ciclo catalitico, l''enzima veniva delicatamente lavato con tampone fosfato e veniva inserita una
nuova soluzione di aldeide a concentrazione 0.5 mMolare. Abbiamo osservato che la velocità e la resa della
reazione appaiono costanti fino al terzo ciclo; al quarto ciclo si osserva un rallentamento della reazione ma
con l''arrivo a completezza della reazione, mentre dal quinto in poi la reazione non riesce più ad arrivare in
fondo.
Per far luce sui fattori che possono influenzare l''inattivazione dell''enzima dopo il quarto ciclo, abbiamo
verificato gli effetti dell''incremento della concentrazione di aldeide sulla resa di reazione. Aumentando la
concentrazione portandola a 5 mMolare (10 volte più concentrata) e 25 mMolare (50 volte più concentrata)
si è osservato un abbassamento della resa, suggerendo subito che l''aldeide di partenza potesse inibire
l''enzima. Questo effetto di inibizione appare purtroppo irreversibile, perché l''enzima supportato 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 cycles 2a Y% 2h 2h 2h 2h 2h 5h 5h 5h 5h 5h 18h 18h 18h 18h 18h 18h 42h 42h accuratamente lavato utilizzato la seconda volta (a concentrazione di aldeide 0.5 mMolare) dopo esser stato
messo in contatto con l''aldeide 5 mMolare, non mostra un''attività completa con rese molto basse.
Combinando assieme il risultato relativo alla bassa resa ottenuta con una concentrazione alta di aldeide è
possibile ipotizzare che alcuni residui amminici dell''enzima posano aver reagito con il substrato carbonilico,
portando quindi alla denaturazione della proteina.
Influenza della concentrazione di aldeide iniziale sulla riduzione enzimatica di 1a a 2a usando l''enzima immobilizz ato in tampone fosfato a pH 7.5,
CH3CN al 10% con NADH catalitico, usando poi etanolo come cosubstrato.

Abbiamo poi esteso lo studio alla bioriduzione di aldeidi alifatiche e aromatiche da parte dell''enzima
immobilizzato s-His-HLADH-EE. Le aldeidi aromatiche sono state trasformate in modo quantitativo nei
rispettivi benzil alcoli, osservando in particolare tempi di reazione più lenti per la p-metossi benzaldeide se
paragonati alla benzaldeide e alla p-nitro benzaldeide. Le aldeidi alifatiche sature e insature hanno portato
alla formazione dei relativi alcoli tutte in maniera quantitativa (Tabella 10).





















0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 2 a , Y % time (h) starting conditions: 1a 0.5 mM, starting conditions: 1a 5 mM, 1st cycle enzyme starting conditions: 1a 25 mM starting conditions: 1a 0.5 mM, 2nd cycle enzyme Immobilized enzyme


Tabella 10 Aldehyde Alcohol Yield% (time, h) 1) benzaldehyde 100 (5) 2) p-methoxybenzaldehyde 95 (20) 3) p-nitrobenzaldehyde 100 (5) 4) Cinnamaldehyde 100 (2) 5) Cyclohexanecarboxyaldehyde 100 (20) 6)
Octanal
100 (5) Attività dell''enzima immobilizzato His-HLADH-EE su aldeidi aromatiche e alifatiche. Condizioni.: Aldeide 0.5 mM , 0.01 mM NADH, 0.5 M EtOH, 0.1 M
tampone fosfato e CH3CN al 10%, pH 7.5, 27°C, V=5 mL, quantità di enzima 50 mg.

Visti i risultati positivi ottenuti su altre aldeidi abbiamo deciso di estendere lo studio alla riduzione di chetoni,
con l''obiettivo di ottenere eventualmente alcoli secondari chirali. Come substrati chetonici abbiamo scelto
tutti quelli qui sotto rappresentati.
Chetoni e chetoesteri usati coem substrati di His-HLADH-EE
In nessuno di questi casi abbiamo osservato la formazione del relativo alcol, aspetto che ha confermato la
specificità dell''enzima His-HLADH-EE nei confronti delle aldeidi e degli alcoli primari. Si ricorda anche
l''inefficienza della reazione quando si utilizza isopropanolo al posto di etanolo nel sistema di riciclo. D''altra
parte Klibanov in un articolo riporta la riduzione di chetoni con l''HLADH commerciale, il quale però è
presente in più isoforme, aspetto che può allargare il range di chemoselettività dei substrati carbonilici che
possono essere ridotti dall''enzima. 155




















155 Grunwald J, Wirz B, Scollar M, Klibanov M. Asymmetric oxidoreductions catalyzed by alcohol dehydrogenase in organic solvents. J Am Chem Soc
as 1986; 108:6732-6734. 2.4 Metodo chemoenzimatico per la sintesi di (S)-Profeni: Ossidazione
La trasformazione dei 2-aril propanoli (alcoli primari) enantiomericamente puri a dare i corrispondenti acidi
2-aril propionici o profeni (acidi carbossilici) è una reazione di ossidazione. Il nostro obiettivo è quello di
compiere l''ossidazione con la massima resa lasciando anche in alterato il centro stereogenico chirale.

Ossidazione degli alcoli primari
La reazione di un alcol primario ad acido carbossilico porta ad incrementare lo stato di ossidazione del
carbonio. E'' una reazione molto studiata in chimica organica ed esistono reagenti che possono portare la
reazione direttamente ad acido carbossilico oppure ad aldeide. In letteratura i reagenti più comuni sono
generalmente metalli pesanti ad elevati stati di ossidazione (Cr(VI), Mn (VII)) anche se di recente stanno
avendo spazio metodologie più ecosostenibili. In particolare anche la biocatalisi sta mostrando la capacità sia
di enzimi isolati che di cellule intere di catalizzare il processo ossidativo.

Ossidazione di alcoli primari ad acidi carbossilici: metodologie chimiche
Una delle metodologie più comuni per l''ossidazione degli alcoli primari ad acidi sfrutta il permanganato di
potassio (KMnO4) come agente ossidante. E'' un reagente fortemente ossidante ed è in grado di ossidare
molti gruppi funzionali oltre agli alcoli primari: alcheni, ossime, solfuri, tioli, alcoli secondari, dioli e aldeidi
L''ossidazione di alcoli primari ad acidi carbossilici è stata descritta in dettaglio la prima volta da Fournier 156 nel 1907, in cui il KMnO4 veniva semplicemente inserito in una sospensione dell''alcol in soluzione acquosa
alcalina. La reazione è poi stata svolta e sviluppata in miscele di acqua con un solvente organico quale il
diossano, la piridina, l''acetone e ilt-BuOH. Normalmente le ossidazioni vengono svolte in condizioni
fortemente alcaline (NaOHoKOH 1N) per avere una miglior velocità di reazione. Ma per molecole sensibili
alle basi, si può effettuare la reazione anche a pH più bassi e/o acidi, ottenendo però un rallentamento della
reazione.
Un''altra metodologia molto comune è l''ossidazione di alcoli primari con il reagente di Jones, datata 1947 157. Il reagente si prepara dissolvendo l''anidride cromica (CrO3) in H2SO4 con la formazione di una soluzione
rossastra contenente acido cromico (H2CrO4) e vari oligomeri. L''ossidazione viene poi svolta dissolvendo
l''alcol primario e il reattivo di Jones in acetone; lo stesso protocollo applicato agli alcoli secondari porta ai
chetoni corrispondenti. L''utilizzo del cromo, particolarmente tossico per l''uomo e per l''ambiente, ha spinto
la ricerca allo sviluppo di una metodologia alternativa del protocollo; Zhao ha sviluppato una procedura in
cui si riduce l''anidride cromica al ruolo di catalizzatore (1-2%) utilizzando l''acido periodico (H5IO6) in eccesso
come ossidante. 158 Un''altra metodologia che coinvolge l''utilizzo di cromo è quella con piridinio clorocromato (PDC), un reagente
normalmente utilizzato per ossidare alcoli primari ad e secondari rispettivamente ad aldeidi e chetoni.
L''ossidazione ad acido carbossilico degli alcoli primari deriva dalla procedura sviluppata da Corey e Schmidt
nel 1979 159, che è legata unicamente all''utilizzo di DMF come solvente. E'' interessante notare come la stessa procedura non ossidi ad acidi carbossilici gli alcoli primari allilici e benzilici.
Una procedura più recente risulta essere l''ossidazione di Heyns, che sfrutta l''ossigeno come ossidante e il
platino su carbone come catalizzatore. La reazione viene normalmente svolta in ambiente neutro o
leggermente basico, con l''utilizzo di bicarbonato.
Un''altra metodologia di ossidazione relativamente recente utilizza il tetraossido di rutenio (RuO4) ossidante
molto forte in grado di ossidare non solo gli alcoli ma anche gli stessi idrocarburi. In questi utilizzi RuO4 è
preparato in situ in quantità catalitiche da RuO2 o RuCl3 e viene rigenerato aggiungendo periodato di sodio;
come solvente si usa una miscela di acetonitrile, acqua e tetracloruro di carbonio. Alla fine si può
aggiungere etere dietilico per precipitare e recuperare il precursore di rutenio. 156 a) Fournier, H.M. (1907). Compt. Rend. Chimie: 331; b) Fournier, H.M. (1909). Bull. Soc. Chim. Fr.: 920.
157 Heilbron, I.; Jones, E.R.H.; Sondheimer, F. (1947), 315, .J. Chem. Soc.: 1586
158 Zhao, M.; Li, J.; Song, Z.; Desmond, R.; Tschaen, D.M.; Grabowski, E.J.J.; Reider, P.J. (1998), Tetrahedron Lett., 39 (30): 5323 159 Corey, E.J.; Schmidt, G. (1979),. Tetrahedron Lett. 20 (52): 399 Dato che il RuO4 è un ossidante molto aggressivo, le reazioni si possono effettuare in condizioni blande, in
genere a temperatura ambiente. L'ossidazione con RuO4 non agisce sui centri stereogenici che non vengono
ossidati. Questo esempio riporta l''utilizzo di RuO4 con N-metil morfolina. 160 Anche l'ossidazione di alcoli epossidici non coinvolge l'anello epossidico:
Ossidazioni chimiche di alcoli primari ''green'
Una nuova procedura di ossidazione di alcol è quella messa a punto da Noyori. 161 Prevede l''uso di acqua ossigenata (H2O2) al 30% in soluzione acquosa come agente ossidante, accompagnato a sodio tungstato
(NaWO4 *2H2O) ed un catalizzatore acido di phase transfer. Questa procedura è diventata molto famosa
perché oltre ad essere applicabile all''ossidazione di molti substrati (olefine, solfuri, alcoli primari e
secondari), è anche molto vantaggiosa in termini di ecosostenibilità e impatto ambientale. La reazione infatti
non utilizza solventi organici e il NaWO4 è un sale non tossico che funge da precatalizzatore: il suo ruolo p
quello di formare un complesso con l'' H2O2 che catalizza il rilascio di O2 con la massima efficienza.
160 A. Schmidt, C. B. W. Stark, 2011, Vol. 13, No. 16 4164''4167
161 Noyori, R.; Aoki, M.; Sato, K. Chem. Commun. 2003, 1977. Il meccanismo di reazione può essere così rappresentato come sull''articolo di Noyori: in primo luogo si ha
l''ossidazione del Na2WO4 per opera della H2O2 a dare un complesso secondo questa reazione:
Na2WO4 + 2H2O2 ' Na2[WO(O2)2(OH)2] + H2O Il perossido risultante A risulta in equilibrio con B e con C in funzione del pH e le specie più reattive sono
proprio queste ultime due. Risulta determinante l''acidità dell''intero sistema e in particolare quella indotta
dal catalizzatore di trasferimento di fase: A prevale fino a pH 4, mentre tra 0.4 e 3 prevale B. Quando
prevale B e si è in condizioni di diluizione, B viene trasferito nella fase organica dal catalizzatore di
strasferimento di fase. Il complesso D subisce poi lo scambio di legante acqua/alcol per formare E: l''alcol
viene poi ossidato e il composto carbonilico ceduto, mentre il catalizzatore G ritorna nella fase acquosa per
venire nuovamente riossidato dall''acqua ossigenata. Il composto carbonilico viene poi successivamente e
nuovamente ossidato ad acido carbossilico. La procedura risulta quindi applicabile a molti alcoli primari e in
particolare si può decidere di fermarla alla formazione di composto carbonilico cambiando la quantità di
H2O2 utilizzata.

Molto recentemente sono apparse diverse metodologie ossidative di alcoli primari ad acidi che utilizzano il
TEMPO (2,2,6,6-tetrametil piperidin N-ossido), un radicale persistente, come ossidante. 162 L''interesse per queste metodologie risiede sicuramente nell''evitare l''utilizzo di metalli pesanti e la possibilità di svolgere la
reazione in condizioni davvero molto blande. Il vantaggio nell''utilizzo del TEMPO è sicuramente il suo basso
costo: esso viene sintetizzato facilmente tramite la condensazione dell''ammoniaca con l''acetone, con
successiva N-ossidazione.
La prima ossidazione con il TEMPO, sottoforma di ossoammonio fu fatta da Golubev, Rozantsev e Neiman
nel 1965, 163 dove fu trasformato l''etanolo in etanale. Successivamente nel 1975 Cella dimostra che un alcol benzilico può essere trasformato nel corrispondente
acido benzoico utilizzando acido metacloro perbenzoico (MCPBA) e quantità catalitiche 2,2,6,6-
tetrametilpiperidina. 164 Il meccanismo suggerito è che il MCPBA ossidi l''ammina al relativo ossoammonio il quale poi promuove
l''ossidazione dell''alcol. Il meccanismo di ossidazione mediato dal TEMPO sembra essere quindi il seguente:
162 http://www.springer.com/cda/content/document/cda_downloaddocument/9780387354316-c6.pdf'SGWID=0-0-45-346628-p173663739 (per tutte le immagini del paragrafo) 163 Golubev. V, Rozantsev E., Neiman M., Izv. Akad. Nauk SSSR Ser. Khim., 1965, 11, 1927
164 Cella. J., Kelley A., Kenehan E., J. Org. Chem, 1975, 40, 1860. R OH N O N O O H H R H H N OH O R OH R HO N O N O O R H OH -H -H N OH O R OH
Risulta importante osservare che:
- l''ossidazione sia dell''alcol che dell''aldeide avvengono interagendo con la forma di ossoammonio
- l''aldeide viene ossidata nella sua forma idrata (il che avviene in generale nella maggiorparte dei
meccanismo di ossidazione)

Nel 1987 Anelli pubblicò un importantissimo articolo in cui mostrava come gli alcoli primari potessero essere
ossidati ad aldeidi o acidi carbossilici in miscele bifasiche CH2Cl2/acqua con NaClO come ossidante
stechiometrico, (derivante dalla candeggina di uso comune) NaHCO3, KBr e 4-metossi-2,2,6,6-
tetrametilpiperidina N-ossido (4-OMe-TEMPO) in quantità catalitica. 165 In particolare la reazione poteva essere fermata ad aldeidi interrompendo la reazione o lasciata andare ad acido carbossilico aggiungendo
anche un catalizzatore di trasferimento di fase per accelerare l''ossidazione.


Il TEMPO in forma di ossoammonio è l''ossidante primario, cioè quello che ossida direttamente il sustrato.
Dopo aver ossidato l''alcol ed essersi ridotto, il TEMPO viene riattivato dall''HOBr (acido ipobromoso),
ossidante secondario, la cui continua formazione viene garantita dall''ossidante stechiometrico, l''ipoclorito.
L''utilizzo di NaClO provocava però clorurazioni su substrati sensibili e Zhao nel 1999 elabora un protocollo in
cui l''ossidante è NaClO2, lasciando l''ipoclorito solo in quantità catalitica. 166 165 Anelli P., Biffi C., Montanari F., J. Org. Chem., 1987, 52, 2559. 166 Zhao M., Mano E., Song Z., Tschaen D., Grabowski E., Reider P. J., J. Org. Chem, 1999, 64, 2564.
In questo protocollo il TEMPO ossoammonio è l''ossidante primario che catalizza la trasformazione di alcoli
ad aldeidi, mentre è il clorito (ClO2 -) l''ossidante primario per le aldeidi. Il ruolo del''ipoclorito, prodotto continuamente dopo l''ossidazione dell''aldeide da parte del clorito, è solo quello di riossidare il TEMPO.
Sempre nel 1999 Epp e Widlanski sostituiscono i sali di cloro inorganici con il bis-acetossi iodobenzene (BAIB)
i cui vantaggi sono la formazione di iodo benzene e acido acetico come sottoprodotti, molecole non dotate
di tossicità. 167 Un altro vantaggio della procedura è la possibilità di evitare l''utilizzo di sali metallici.
Tutti queste procedure hanno in comune l''utilizzo del TEMPO, che funge sempre da ossidante primario per
gli alcoli primari, ma non sempre per le aldeidi; nel protocollo di Zhao infatti, l''aldeide viene ossidata dal
clorito. Il TEMPO riesce a ossidare questi gruppi funzionali nella sua forma di sale di ossammonio. E'' anche
interessante notare che tutte queste procedure necessitino di un sistema di ossidazione stechiometrico
secondario o a volte ''semi-primario'. Recentemente sono usciti molti altri esempi di sistemi compatibili coil
TEMPO: Ca(ClO)2, 168 t-BuOCl,169 CuCl-O2,170 Br2171 e acido tricloroisocianurico.172 167 Epp J. B., Widlanski T. S., J. Org. Chem., 1999, 64, 293. 168 Ying L., Gervay-Hague J., Carbohydr. Res., 2003, 338, 835
169 Li K., Helm R. F., Carbohydr. Res., 1995, 273, 249
170 Semmelhack M. F., Schmid C. R., Cortès D. A, Chou C. S., J. Am. Chem. Soc, 1984, 106, 3374.
171 Merbouh N., Bobbitt J. M., Bruckner C., Carbohydr. Res., 2002, 21, 65. 172 De Luca L., Giacomelli G., Masala S., Porcheddu A., J. Org. Chem., 2003, 68, 4999 E'' interessante notare anche un altro aspetto; nonostante il TEMPO sia in effetti un radicale, tutte le
ossidazioni sopracitate avvengono tramite un meccanismo ionico.

2.4.1 Ossidazione chimica dei 2S-aril propanoli 173 Come si è potuto osservare, le metodologie per l''ossidazione di alcoli primari ad acidi carbossilici sono
particolarmente numerose. In accordo con la scelta della metodologia che porti alla resa maggiore e alla
ritenzione di configurazione del centro steeogenico, sono sate scelte le procedure con il più alto indice di
ecosostenibilità, in accordo con i principi della Green Chemistry.
Abbiamo quindi scelto di studiare la reazione di ossidazione con due protocolli: quello di Noyori e quello di
Zhao, confrontandoli con una metodologia poco sostenibile che sfrutta il KMnO4 come ossidante.
Gli alcoli scelti sono i 2-aril propanoli che abbiamo già incontrato nei capitol precedenti e che fanno parte
delle strutture dei Profeni più importanti. O F O O OH OH OH OH OH 2a 2b 2c 2d 2e 2f OH OH OH 2g O OH 2h O Gli alcoli scelti sono stati rappresentati nella figura soprastante. Tutti gli alcoli del 2-Fenil Propanolo ((S,R)-2a,
(S)-2a, and (R)-2a ) sono commercialmente disponibili; gli alcoli (2b-2h) in forma racema vengono ottenuti
tramite riduzione con BH3'SMe2 dei relative acidi commerciali ed enantiomericamente puri (S)-2b-h tramite
il processo di bioriduzione enantioselettiva mediato dall''enzima HLADH.
La procedura di ossidazione dell''(S)-Ibuprofenolo ((S)-2b) con KMnO4 in condizioni acide è già presente in
letteratura 7 (Table 11, entry 1), ma abbiamo deciso di applicarla comunque sui substrati (S)-2a, (S)-2c, and (S)-2d ottenendo dei risultati molto scarsi (Table 11, entries 3-4). Si ricorda che l''ossidazione con KMnO4
procederebbe meglio con catalisi basica, ma queste condizioni faciliterebbero la racemizzazione dell''aldeide
chirale intermedia e quindi la perdita della purezza enantiomerica. In conclusione questa procedura ha
portato a rese molto basse in acido carbossilico e alla contemproanea presenza di quantità significative del
relativo arilchetone 3 a,c,d (della cui sintesi è già stato discusso in precedenza). E'' stata comunque verificata
la ritenzione di configurazione per del prodotto (S)-4a, ottenuto dall''ossidazione di (S)-2a.
L''applicazione del protocollo di Noyori con H2O2, NaW catalitico al 2% e Aliquat 138) come catalizzatore di
trasferimento di fase e ha portato in generale a basse rese anche aumentando la quantità di catalizzatore
fino al 10% (Table 11, entries 9 and 11). La sostituzione dell''H2O2 con acido peracetico e dell''Aliquat con
Bu4NHSO4 non ha portato ad alcun miglioramento (Table 11, entries 10-13). Per escludere anche in questo
caso il manifestarsi della racemizzazione del centro stereogenico è stata verificata e accertata la purezza
enantiomerica di (S)-4a e (R)-4a per ossidazione di (S)-2a or (R)-2a. (Table 11, entries 7-8).
OH R R 2a-d 4 a-d OH O oxidation + R O O R + 1 a-d 3 a-d

Tabella 11 173 P. Galletti, M. Pori, D. Giacomini, ''One-Step Oxidation of 2-Arylpropanols to 2-Arylpropionic Acids: Improving Sustainability in the Synthesis of
Profens', Synlett, 2010, 17, 2644-2648 Entry Alcohol Oxidation Methodology Resa 4 S/R (4) Resa (1) Resa (3) 1 (S)-2b KMnO4, acetone/H2SO4 3N, 0 °C 77 c 2 (S)-2a KMnO4, acetone/H2SO4 3N, 0 °C 36 55 3 (S)-2c KMnO4, acetone/H2SO4 3N, 0 °C 47 >99/1 50 4 (S)-2d KMnO4, acetone/H2SO4 3N, 0 °C 51 >99/1 12 5 (S,R)-2a H2O2, Na2WO4 2%, Aliquat 138 2%, KHSO4 2%, 90 °C 27 - 10 30 6 (S,R)-2a H2O2, Na2WO4 2%, Aliquat 138 2%, KHSO4 2%, rt 12 - 40 7 (S)-2a H2O2, Na2WO4 2%, Aliquat 138 2%, KHSO4 2%, 90 °C 20 >99/1 5 17 8 (R)-2a H2O2, Na2WO4 2%, Aliquat 138 2%, KHSO4 2%, 90 °C 25 <1/99 2 16 9 (S,R)-2a H2O2, Na2WO4 10%, Aliquat 138 10%, KHSO4 10%, 90 °C 40 - 4 28 10 (S,R)-2a H2O2, Na2WO4 2%, Bu4NHSO4 2%, 90 °C 20 - 2 18 11 (S,R)-2a H2O2, Na2WO4 10%, Bu4NHSO4 10%, 90 °C 36 - 9 40 12 (S,R)-2a CH3COOOH, Na2WO4 10%, Bu4NHSO4 10%, 70 °C 5 - 5 30 13 (S,R)-2b H2O2, Na2WO4 20%, Bu4NHSO4 20%, 90 °C 15 - 15 44 a Resa dei composti isolati. b Resa stimata da GC o HNMR del grezzo.

L''applicazione di questi due protocolli ha portato in conclusione a basse rese seppure con la ritenzione della
configurazione dell''alcol di partenza; inoltre sono sempre stati osservati importanti quantitativi di arilchetoni
derivanti dalla scissione ossidativa del legame C-C, fenomeno già osservato nell''ossidazione dell''alcol
omobenzilico con PCC, nell''ossidazione del cumene con H2O2 e complessi di manganese (III) con
porfirine. 174Ma proprio la conversione della 2-fenil propanale ad acetofenone avviene se mediata da catalisi metallica. 175 La catalisi metallica quindi fa convergere sia i 2-aril propanoli che le 2-aril propanali verso la formazione dei sottoprodotti non desiderati, gli arilchetoni, inficiando la resa nei rispettivi acidi carbossilici.
Il protocollo di Zhao, che utilizza il TEMPO come ossidante primario, non è legato all''utilizzo di metalli e
quindi può essere promettente. La procedura oltre all''utilizzo di TEMPO sfrutta l''NaOCl come catalizzatore e
l''NaClO2 come ossidante in un sistema CH3CN-tampone. Le prime prove di ossidazione hanno mostrato
ottimi risultati e rivelato quindi l''alta efficienza del protocollo. In tutti i casi gli acidi 2-arilproprionici vengono
direttamente isolati tramite work-up acido-basecon purezze >99%. L''acido 2-Fenil Propanoico (4a),
l''Ibuprofene (4b), il Flurbiprofene (4c) e il Fenoprofene (4d) sono stati isolati in rese eccellenti. In alcuni casi
la reazione è stata molto lenta ed è stato necessario l''introduzione di altro catalizzaore/ossidante. (Table 12,
entries 1, 5, 7, or 12).
OH R R 2 a-h 4 a-h OH O NaClO2,
NaClO cat, TEMPO cat CH3CN/buffer pH 6.7/H2O












174 a) Baciocchi, E.; Belvedere, S.; Bietti, M., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 4711; b) Tokunaga, M.; Aoyama, H.; Shirogane, Y.; Obora, Y.; Tsuji, Y. Catal.
Today 2006, 117, 138 175 Tokunaga, M.; Aoyama, H.; Shirogane, Y.; Obora, Y.; Tsuji, Y. Catal. Today 2006, 117, 138 Tabella 12














a Resa dei prodotti isolati. b Eccesso enantiomerico degli acidi coerente con quello degli acidi di partenza


Il Naprossene (4e) è stato ottenuto in media in rese più basse probabilmente a causa della bassa solubilità
nel sistema H2O/CH3CN dell''alcol di partenza (2e), oppure per via del potere disattivanete della catena
metossi naftalenica (Table 12 entries 9-11). Sono state osservate basse rese anche per il Ketoprofene 4f
partendo da 2f e nulle partendo da 2g (Table 12 entries 12-17), probabilmente a causa della possibile
formazione di un radicale stabile di natura benzofenonica che blocca il ciclo catalitico ossidativo. Per
risolvere il problema e verificare la nostra ipotesi abbiamo sintetizzato il derivato 2h. Il derivato è stato
sintetizzato trasformando il ketoprofene acido nell''estere metilico, proseguendo alla sintesi dell''acetale con
glicole etilenico sul gruppo chetonico e riducendo poi l''estere ad alcol primario con NaBH4.
O OH O H+, EtOH O OEt O HO OH Toluene, TsOH ' ' O OEt O O OH O O 4f 2h NaBH4 MeOH Come aspettato, l''ossidazione del gruppo alcolico ad acido carbossilico di 1h è avvenuta con successo; si è
poi facilmente proceduto alla rimozione del gruppo acetalico tramite catalisi acida. In tutte le prove
effettuate, anche in quelle con bassa resa, la formazione dei relativi arilchetoni è risultata molto bassa come
anche la presenza di aldeide non reagita. La formazione e la permanenza dell''aldeide in questo sistema può
rappresentare un problema in quanto può intervenire un fenomeno di racemizzazione del centro chirale per
tatutomeria cheto-enolica. Tuttavia questo fenomeno è risultato essere molto limitato vista la completa
ritenzione di configurazione degli acidi 2-arilproprionici ottenuti: ciò probabilmente è dovuto al fatto che in
queste condizioni l''aldeide è rapidamente ossidata dall''eccesso di clorito presente e quindi la sua
ossidazione è più veloce della racemizzazione (Si veda il meccanismo dell''ossidazione con il metodo di Zhao). Entry alcohol T (°C) NaClO2 (eq) NaClO (%) TEMPO (%) Time (h) 4 Y (%) (S)/(R) 1 (S,R)-2a 35 2 2 2 6 93 2 (S)-2a 35 2 2 2 4 88 >99/1 3 (R)-2a 35 2 2 2 4 92 >1/99 4 (S)-2b 35 4 4 4 21 99 >99/1 5 (S,R)-2c rt 3 4 4 24 88 6 (S)-2c rt 3 4 4 24 85 98/2 b 7 (S,R)-2d 35 3 4 4 24 97 8 (S)-2d 35 3 4 4 26 96 98/2 b 9 (S,R)-2e Rt 4 6 6 21 65 10 (S,R)-2e 35 3 4 4 20 32 11 (S)-2e rt 4 6 6 26 59 >99/1 12 (S,R)-2f Rt 4 6 6 24 25 13 (S,R)-2f 35 3 4 4 24 40 14 (S)-2f 35 3 4 4 24 42 97/3 b 15 (S,R)-2g Rt 8 12 12 24 - 16 (S,R)-2g 35 6 8 8 20 - 17 (S,R)-2h rt 3 4 4 20 62
Ossidazione di alcoli primari ad acidi carbossilici: metodologie biocatalitiche
Oltre alle importanti metodologie chimiche per l''ossidazione di alcoli primari ad acidi carbossilici, esistono
anche innovative e interessanti procedure che utilizzano la biocatalisi; in questo ambito ci sono stati spesso
buoni risultati con l''utilizzo di cellule intere, 176 in cui l''enzima che in effetti catalizza l''ossidazione non è del tutto indentificato.
La reazione più famosa e conosciuta da secoli dall''uomo è la sintesi dell''acido acetico per fermentazione
ossidativa (aerobica) dell''etanolo per opera di Acetobacter. La reazione chimica complessiva facilitata da
questi batteri è: CH3CH2OH + O2 '' CH3COOH + H2O Se una soluzione diluita di alcool viene inoculata conAcetobactere viene mantenuta in un luogo caldo e
arieggiato, essa diventerà aceto nel giro di pochi mesi. L'industria produttrice di aceto accelera questo
processo fornendo un supplemento di ossigeno ai batteri.
Recentemente il gruppo di ricerca del professor Molinari ha riportato l''utilizzo di Acetobacter aceti MIM
2000/28 nell''ossidazione del 2-fenil etanolo al relativo acido carbossilico. 177 In particolare l''attività di questo ceppo batterico è anche risultata modulabile: in solvente acquoso viene prodotto l''acido carbossilico,
mentre in un sistema bifasico acqua/isoottano viene prodotta la relativa aldeide. Un ulteriore miglioramento
è stata la possibilità di immobilizzare le cellule in alginato di calcio, le quali hanno mostrato comunque
grandie attività riuscendo a produrre fino a 23g/L di acido fenilacetico in 9 giorni senza formazione di
emulsioni.
Un altro esempio messo in luce da Ohta sfrutta due enzimi estratti dal microorganismo Brevibacterium:
PEDH (feniletanolo deidrogenasi) e PADH (fenilacetaldeide deidrogenasi). 178 Questi enzimi NADH dipendenti catalizzano l''ossidazione di vari alcoli primari ad acidi, accoppiati ad un altro enzima, una NOX (NADH
ossidasi) estratta da Lactobacillus Brevis 179 che rigenera il NAD+ grazie all''ossigeno. Recentemente Riva ha riportato l''ossidazione del CH2OH terminale di beta e α-glucorosidi monosaccaridici e
disaccaridici a COOH con l''ottenimento degli analoghi glucuronosidi, tramite l''utilizzo di una laccasi, una
ossidasi estratta dall''organismo Trametes Pubescens. 180
Le laccasi 181 sono note per condurre reazioni di ossidazione, ma normalmente in chimica organica vengono utilizzate per catalizzare l''ossidazione di un alcol primario ad aldeide o alcoli secondari a chetoni 182. Sono in 176 W. Kroutil, H. Mang, K. Edegger, K. Faber, Adv. Synth. Catal., 2004, 346, 125 ± 142
177 R. Gandolfi, K. Cavenago, R. Gualandris, J. Gagob, F. Molinari, Process Biochemistry, 39 (2004) 747''751
178 J. Hirano, K. Miyamoto, H. Ohta, Tetrahedron Letters 49 (2008) 1217''1219 179 Hummel, W.; Riebel, B. Biotechnol. Lett. 2003, 25, 51.
180 a) Marzorati M, Danieli B, Haltrich D, Riva S: Green Chem 2005, 310-315; b) Baratto L, Candido A, Marzorati M, Sagui F, Riva S, Danieli B: J Mol Cat B:
Enzym 2006, 39: 3-8
181 A. Kunamneni, S. Camarero, C. García-Burgos, F. Plou, A.Ballesteros and M. Alcalde, Microbial Cell Factories 2008, 7:32
182 a) Baiocco P, Barreca AN, Fabbrini M, Galli C, Gentili P, Org Biomol Chem 2003, 1:191-197. 39; b) Fabbrini M, Galli C, Gentili P: J Mol Catal B Enzym
2002, 16:231-240. 40; c) Fritz-Langhals E, Kunath B, Tetrahedron Lett 1998, 39:5955-5956. 41; d) Potthast A, Rosenau T, Chen CL, Gratzl JS, J Mol
Catal A Chem 1996, 108:5-9. 42; e) Fabbrini M, Galli C, Gentili P, Macchitella D, Tetrahedron Lett 2001, 42:7551-7553. grado anche di catalizzare reazioni di accoppiamento con fenoli e steroidi 183, reazioni di polimerizzazione e costruzione di legami carbonio-azoto 184. Le laccasi (EC 1.10.3.2, p-diphenol: dioxygen oxidoreductase) 185 sono delle glicoproteine ubiquitarie in natura e appartengono alla famiglia delle ''ossidasi blu', dette così in quanto rame dipendenti. La maggiorparte di
loro consiste in una struttura monomerica, anche se esistono molte laccasi di natura multimerica. 186 Il peso molecolare medio si aggira attorno a 60-70 kDa e il contenuto medio di carboidrati è tra il 10 e il 20%; si
ipotizza che la funzione dei carboidrati (generalmente mannosio, galattosio ed N-acetil glucosammina) sia
quella di stabilizzare molto queste proteine. Sono presenti in molte piante e sostanzialmente in tutto il regno
dei funghi e recentemente la loro presenza è stata riscontrata anche negli insetti.

Queste proteine possono essere secrete dai microorganismi o localizzarsi dentro le cellule e ad esse sono
attribuite numerose funzioni biologiche: pigmentazione, 187 lignificazione della parete cellulare,188 biodegradazione della lignina, turn-over dell''humus e processi di detossificazione 189 e regolazione omeostatica del ferro e del rame. 190 A livello industriale questi enzimi sono usati in maniera massiccia nello sbiancamento della carta, 191 nella modifica dei coloranti tissutali, 192 nel trattamento della lignina o materiali basati su essa tramite processi di cross-linking, 193nella detossificazione dagli inquinanti e trattamento dei reflui.194 Tutti questi processi, sia in ambito biologico che applicativo, sono resi possibili dalle reazioni che è in grado
di catalizzare questo enzima: reazioni di polimerizzazione/depolimerizzazione e reazioni di ossidoriduzione.
Il meccanismo di azione della laccasi è catalizzato dalla ossidazione monoelettronica dell''opportuna
molecola-substrato (fenolo, molecole aromatiche, ammine alifatiche..) tramite ossigeno, la quale viene
trasformata in un radicale reattivo.

Questo processo avviene con l''ausilio di un cluster di quattro atomi di rame, che costituiscono il nucleo
catalitico dell''enzima. Gli atomi di rame sono disposti in 3 siti redox (T1,T2 e T3); T1 e T3 contengono un
atomo di rame, il sito T2 ne contiene 2. Il sito 1 (T1) è localizzato a 12 Angstrom dal cluester trinucleare T2 e
T3, luogo in cui avviene la riduzione dell''ossigeno e la formazione di acqua. 195 183 Ponzoni C, Beneventi E, Cramarossa MR, Raimondi S, Trevisi G, Pagnoni UM, Riva S, Forti L, Adv Synth Catal 2007, 349:1497-1506
184 Mikolasch A, Hammer E, Jonas U, Popowski K, Stielow A, Schauer F, Tetrahedron 2002, 58: 7589-7593
185 S. Riva, TRENDS in Biotechnology, 2006, 24, 5 186 Marques De Souza CG, Peralta RM. JBasic Microbiol 2003, 43(4):278-286.
187 Williamson PR, Wakamatsu K, Ito S, J Bacteriol 1998, 180:1570-1572
188 O' Malley DM, Whetten R, Bao W, Chen CL, Seedorf RR, Plant J 1993, 4:751-757
189 Baldrian P: FEMS Microbiol Rev 2006, 30:215-242
190 Stoj C, Kosman DJ: FEBS Lett 2003, 554:422-426
191 Bourbonnais R, Paice MG, Freiermuth B, Bodie E, Borneman S, Appl Environ Microbiol 1997, 63(12):4627-4632.
192 a) Abadulla E, Tzanov T, Costa S, Robra KH, Cavaco-Paulo A, Gübitz GM: Appl Environ Microbiol 2000, 66:3357-3362; b) Kunamneni A, Ghazi I,
Camarero S, Ballesteros A, Plou FJ, Alcalde M: Process Biochem 2008, 43:169-178.
193 Widsten P, Tuominen S, Qvintus-Leino P, Laine JE, Wood Sci Technol, 2004, 38:521-528.
194 Bergbauer M, Eggert C, Kraepelin G, Appl Microbiol Biotechnol 1991, 35:105-109; b) Berrio J, Plou FJ, Ballesteros A, Martinez AT, Martinez MJ:
Biocatal Biotransform 2007, 25:130-134.
195 Piontek, K. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, 37663''37669. La presenza di questi atomi di rame, spesso gli enzimi isolati assumono la colorazione blu tipica
dell''assorbimento del rame. Il processo complessivo consiste quindi nella riduzione di una molecola di
ossigeno a due molecole di acqua con la concorrente ossidazione di quattro molecole di susbtrato e la
produzione di quattro radicali; gli atomi di rame passano dallo stato di ossidazione +2 a +1.
I quattro radicali che derivano dal susbtrato possono produrre dimeri, e poi oligomeri e poi polimeri, o
possono a loro volta ossidare un altro substrato e quindi dare vita ad un vero e proprio circolo di elettroni,
un ciclo ossidativo. 196
Tutti i potenziali casi cui va incontro il meccanismo di ossidazione della laccasi sono qui rappresentati:
1) Nel primo caso, il più semplice, il susbtrato è direttamente ossidato dalla laccasi per interazione con il
cluster di rame.
2) Spesso però, soprattutto nell''ambito della biocatalisi, può succedere di dove sfruttare le laccasi per
ossidare un determinato substrato che però non può essere direttamente ossidato dall''enzima. Questo può
succedere per svariati motivi: a) incapacità del substrato di ossidarsi secondo il meccanismo mono eletronico
della laccasi; b) il substrato potrebbe non essere in grado di penetrare nel sito attivo dell''enzima; c)
l''ossidazione del susbstrato richiede un potenziale redox pià elevato.
Il problema può essere risolto dall''utilizzo di una molecola detta mediatore: la molecola per esserlo deve
potersi ossidare secondo il meccanismo della laccasi ma allo stesso tempo ossidare il nostro susbtrato di
interesse. E i mediatori a volte possono essere anche più di uno, come il sistema con la FADH
196 a) Claus, H. 2004, Micron, 35, 93''968;b) Solomon, E.I. et al. 1996 Chem. Rev. 96, 2563''2605.
Il meccanismo di interazione della laccasi con un mediatore è comune anche in natura. Infatti se i funghi
sono in grado di depolimerizzare la lignina tramite le laccasi, è impensabile pensare che un substrato
ingombrante come un polimero possa entrare nel sito attivo dell''enzima. E infatti l''incubazione di laccasi con
la lignina da sola non porta a nessuna reazione. 197 L''utilizzo di un mediatore offre quindi molti vantaggi: a) l''allargamento del range del potenziale redox
dell''enzima, che può passare da 500-700 mV a oltre 1100 mV; b) l''aumento della velocità e della resa delle
reazioni; c) la capacità di ossidare molecole molto diverse dai tipici substrati dell''enzima.
Tra i mediatori più utilizzati qui rappresentati, il primo artificiale è stato l''ABTS, utilizzato proprio per
depolimerizzare la lignina.

La scelta del mediatore giusto per la trasformazione chimica è un aspetto veramente cruciale, perché al di là
del potenziale redox e dell''aumento della velocità e della resa, risulta importante basarsi sul meccanismo di
ossidazione che necessita il substrato. L''ABTS per esempio ossida secondo un meccanismo di trasferimento
di elettroni (ET); l''HBT invece effettua un trasferimento dell''atomo di idrogeno (HAT), da parte del radicale
nitrossile (N-O'); il TEMPO (e i derivati) seguono invece un meccanismo di natura ionica esplicato dalla
struttura del sale di ossamonio (come peraltro si è osservato nei protocolli di ossidazione di Anelli e di Zhao).

Tuttavia anche l''utilizzo dei mediatori ha degli svantaggi: sono molecole molto spesso costose e i
sottoprodotti sono tossici. Inoltre a volte lo stesso mediatore potrebbe inattivare l''enzima o essere
trasformato in una molecola non più in grado di svolgere il compito di trasferitore di elettroni. Si sta quindi
cercando di rivolgersi all''utilizzo di mediatori ''low-cost' e soprattutto di origine naturale come fenoli e
aniline, laddove possibile compatibilmente al meccanismo di ossidazione richiesto.

Il nostro interesse nel mettere a punto una metodologia biocatalitica di ossidazione dei nostri S 2 aril
propanoli a profeni ci ha spinti a studiare una laccasi come catalizzatore. Le prime prove sono state
effettuate ispirandoci alle condizioni che Riva utilizza per l''ossidazione dei glucosidi, utilizzando il 2-Fenil
propanolo come molecola iniziale su cui iniziare lo studio. Riva utilizza come laccasi quella estratta 197 Bajpai, P. (1999), Biotechnol. Prog. 15, 147''157. dall''organismo fungino Trametes Pubescens ma noi abbiamo deciso di utilizzare l''enzima estratto da
Trametes Versicolor 198 molto utilizzato in ambito industriale e facilmente reperibile. Le condizioni iniziali quindi prevedono l''utilizzo di 80 U di enzima (1 U corrisponde alla quantità di enzima
che converte 1 micromole di catecolo al minuto a pH 4.5 a 25°C) 199 per millimole di susbtrato alcolico, il 20% di TEMPO (Riva utilizza quantità di TEMPO che variano tra il 10% e il 20%) rispetto al susbtrato alcolico da
ossidare e come solvente un tampone acetato a pH 4.5. Risulta anche molto importante effettuare la
reazione in una beuta all''aria, essendo la laccasi una ossidasi bisognosa di ossigeno. Abbiamo quindi
effettuato uno screening iniziale sul 2-Fenil propanolo racemo variando il solvente, il pH, la temperatura, la
quantità di TEMPO ed enzima utilizzati rispetto al susbtrato e in particolare la modalità di ossigenazione.
Tabella 13 Entry Substrato Mediatore (%) Solvente O2 T Time Resa Acido HPLC Chirale 1 Alcol / AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 7 gg 0% 2 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 6 gg 53% 3 Aldeide TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 6 gg 4 Acido TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 6 gg 5 Chetone TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 6 gg 6 (R)-Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 5 gg traccia (R)/(S) = 77/23 7 (S)-Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 5 gg traccia (R)/(S) = 8/92 8 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M All'aria/ Aperto RT 5 gg 30% (R)/(S) = 50/50 9 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 6 gg 60% 10 Alcol / AB pH 4.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 9 gg 0% 11 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5, 0.1 M Chiuso RT 9 gg traccia 12 Alcol TEMPO (100%) AB pH 4.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 2 gg 77% 13 Alcol ABTS (20%) AB pH 4.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 9 gg 0% 14 Alcol a TEMPO (100%) AB pH 4.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 7gg 0% 15 Alcol TEMPO (20%) PBS pH 6.5, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 7gg 0% 198 Fu, Jiajia; Nyanhongo, Gibson S.; Guebitz, Georg M., Biocat and biotrans., 2012, 30, 1, 125-140
100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/51639'lang=it&region=IT

16 Alcol TEMPO (20%) Citrate pH 3.0, 0.1 M Bubbled/chiuso RT 8gg 0% 17 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5 0.1 M / DCM 50% Bubbled/chiuso RT 9 gg 0% 18 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5 0.1 M / MTBE 50% Bubbled/chiuso RT 9 gg 0% 19 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5 0.1 M / tBuOH 10% Bubbled/chiuso RT 7gg 15% 20 Alcol TEMPO (20%) AB pH 4.5 0.1 M + MeCN 10% Bubbled/chiuso RT 6 gg 5%
Le prime prove (Tabella 13, entries 1-8) sono state svolte tutte all''aria, utilizzando tampone acetato a pH 4.5
a concentrazione 0.1 Molare, utilizzando 68 U di enzima per millimole di substrato. La entry 2 ha portato ad
una resa nell''acido del 53% con la presenza di qualche impurezza non nota dopo 6 giorni e ha mostrato
l''importanza del TEMPO come catalizzatore. Infatti se non è presente (Tabella 13, entry 1) la reazione non
procede. Per verificare l''effetto dell''enzima laccasi sugli intermedi, i prodotti e i sottoprodotti (Tabella 13,
entries 3-5), rispettivamente la 2-fenil propanale, l''acido 2-fenil propanoico e l''acetofenone, abbiamo
studiato il comportamento di questi prodotti con laccasi. Questo aspetto risulta molto importante da
approfondire perché la laccasi, per via del suo meccanismo di ossidazione monoelettronica, potrebbe avere
un''attività ossidante sull''anello aromatico. L''aldeide si è completamente ossidata ad acido, l''acido è rimasto
inalterato mentre l''acetofenone ha portato alla formazione di sottoprodotti non identificati. Abbiamo deciso
di verificare se la laccasi potesse avere un comportamento differente in funzione dell''enantiomero R o S
(Tabella 13, entries 6-8), verificando tramite HPLC chirale la configurazione dell''acido risultante; abbiamo
osservato che in tutti i casi l''ossidazione procedeva ma l''acido risultante da R o da S non era
enantiomericamente puro (rispettivamente R/S = 77/23 partendo dall''alcol R, R/S = 8/92 partendo da S, R/S
= 50/50 partendo dall''alcol racemo). Visto che l''ossidazione del racemo portava ad un acido racemo
abbiamo ipotizzato che l''enzima non fosse enantiospecifico e nel caso dell''alcol R o S la parziale
racemizzazione possa essere intervenuta sull''aldeide o sull''acido per via del pH acido tramite l''equilibrio
chetoenolico.
In tutti i casi qui rappresentati abbiamo osservato dei valori di resa molto diversi e bassi per ciascuna prova e
abbiamo pensato che i tempi di reazione associati all''utilizzo di un sistema aperto potessero causare una
facile volatilizzazione degli intermedi, tra cui l''aldeide. Abbiamo quindi cominciato a svolgere le reazioni in
un sistema chiuso gorgogliando ossigeno gassoso ottenendo miglior risultato in termini di resa (60%, Tabella
13, entry 9), dove l''unico sottoprodotto osservato è risultato essere l''acetofenone, dove la sua maggior
presenza può essere dovuta alla concentrazione superiore di ossigeno che può causare e facilitare il cleavage
ossidativo dell''aldeide. Per verificare che l''eccesso di ossigeno non fosse in grado di catalizzare l''ossidazione
del substrato senza l''aiuto di altri ossidanti, abbiamo svolto una prova con enzima e senza TEMPO (Tabella
13, entry 10) e una con il TEMPO ma senza l''enzima (Tabella 13, entry 14), entrambe negative. Questi
risultati sembrano dimostrare come l''ossidazione del 2-Fenil propanolo sia fortemente legata alla triade
ossidativa O2-Laccasi-TEMPO. Osservando i tempo di reazione spesso molto lunghi abbiamo deciso di
verificare l''effetto di una maggior quantità di TEMPO sulla velocità di reazione, osservando che il mediatore
in quantità equimolare rispetto all''alcol ne provoca l''ossidazione in 2 giorni invece che 6 con una resa del
77%. L''utilizzo di ABTS al 20% alternativamente al TEMPO non ha fatto progredire la reazione, dimostrando
che la scelta del mediatore è giusta e che l''ossidazione necessita di un meccanismo di natura ionica.
Variazioni di pH del solvente (pH 3 e pH 6.5) hanno bloccato l''attività dell''enzima, che in effetti risulta avere
la massima attività tra 4 e 5.5. L''utilizzo di solventi organici e cosolventi con l''obiettivo di facilitare la solubilità del substrato e velocizzare la reazione ha portato a risultati molto scarsi e insoddisfacenti (Tabella
13, entries 17-20).
Tabella 14 Entry Sm Mediat. Solv. O2 T Time Resa Acido (STIMA) HPLC Chirale 1 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 2 gg 74% 2 Alcol TEMPO (20%) milliQ / NaCl 0.1 M Bubbled/chiuso RT 9 gg traccia 3 a Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 2gg 60% 4 Alcol TEMPO (10%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 2gg 45% 5 (S)-Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 2gg 92% (R)/(S) = 0/100 6 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ / DMSO 10% Bubbled/chiuso RT 5 gg 100% ' 7 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ / DMSO 30% Bubbled/chiuso RT 5 gg 0% 8 Alcol TEMPO H2O milliQ / Acetone 10% bubbled/chiuso RT 6 0% 9 Alcol TEMPO H2O milliQ / THF 10% bubbled/chiuso RT 7 0% 10 Alcol Hobt (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 4 gg 0% 11 Alcol HoBt (20%) + TEMPO (2%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 3 gg traccia 12 Alcol metilestere dell'acido siringico H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 6 gg 0% 13 Alcol 4-OH TEMPO (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 3 gg 15% 14 Alcol 4-NH2 TEMPO (20%) H2O milliQ Bubbled/chiuso RT 3 gg 0% 15 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ + Aliquat (20% in Volume) Bubbled/chiuso RT 3 gg 0% 16 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ +C10MimNTf2 (20% in volume) Bubbled/chiuso RT 3 gg 0% 17 Alcol TEMPO (20%) H2O milliQ +N(But)4HSO4 (0.02 mmol) Bubbled/chiuso RT 3 gg 0% aQuantità quadrupla di enzima utilizzato

Tuttavia l''utilizzo di acqua milliQ, ha portato a risultati molto buoni in termini di resa 77% (Tabella 14, entry 1)
e abbiamo deciso di ottimizzare ed effettuare altre prove con questo solvente Per vedere l''effetto della forza
ionica abbiam condotto una reazione in acqua milliQ con aggiunta di NaCl (Tabella 14, entry 2) osservando solo la formazione di una traccia di prodotto Per velocizzare ulteriormente la reazione abbiamo utilizzato
una quantià di enzima quadrupla rispetto all''alcol (Tabella 14, entry 3), ma senza alcun risultato interessante
in termini di resa. Abbiamo quindi verificato nuovamente l''effetto dei mediatori. L''utilizzo del 10% di TEMPO
porta dopo due giorni al 45% di resa con la presenza di molte impurezze (Tabella 14, entry 4). Questa volta
l''utilizzo di 2S-2-Fenil Propanolo ha portato all''acido S come unico enantiomero, mostrando come queste
condizioni non favoriscono evidentemente la racemizzazione (Tabella 14, entry 5). Stranamente l''utilizzo di
analoghi del TEMPO come il 4-idrossi TEMPO e il 4-ammino TEMPO (Tabella 14, entries 13,14) non portano a
risultati sodisfacenti. L''utilizzo di mediatori diversi dal tempo e diversi dall''ABTS, l''HoBT e il metil siringato
(che dovrebbero agire secondo un meccanismo HAT) non porta alla formazione di acido; solamente l''utilizzo
di Hobt associato al TEMPO, con la formazione di un sistema di doppio mediatore, porta ad una traccia di
acido (Tabella 14, entries 10-12). Per quanto riguarda l''utilizzo di cosolventi (Tabella 14, entry 6-10) solo con
DMSO al 10% si è avuto una conversione completa ad acido; l''utilizzo però del 30% di DMSO ha bloccato
l''attività dell''enzima. L''utilizzo di liquidi ionici e/o surfattanti ha in questo caso bloccato l''attività enzimatica
(Tabella 14, entries 15-17).

Questi risultati sul 2- Fenil propanolo ci hanno portato a ipotizzare il seguente meccanismo.
LAC N O N OH O O O O LAC2+ 2 H2O LAC N O H H H O N O OH O H OH O O O
Come si vede, il TEMPO sembra essere fondamentale non solo per ossidare l''alcol ad aldeide, ma anche per
ossidare quest''ultima ad acido carbossilico. Il meccanismo di azione del TEMPO sull''aldeide è possibile solo
se essa è in forma idratata come d''altra parte prevede la letteratura. E'' interessante paragonare questa
ossidazione alla metodologia di Zhao che abbiamo precedentemente utilizzato per ossidare il 2-Fenil
Propanolo e gli altri propanoli. Con questo meccanismo l''aldeide intermedia è necessariamente ossidata dal
TEMPO (dal TEMPO in forma di ossoammonio, possibile solo tramite l''intervento dell''enzima laccasi e
dell''ossigeno), mentre Zhao mostra come essa sia ossidata direttamente e velocemente dall''NaCl2O,
l''ossidante stechiometrico.
Per verificare comunque questa ipotesi, abbiamo provato a mettere la 2-fenil propanale in acqua milliQ
unicamente con ognuno dei tre ossidanti: a) Enzima; b) O2 ; c) TEMPO. La reazione come previsto non è
andata in nessuno dei tre casi. Questo ha dimostrato che l''enzima da solo non è in grado di ossidare l''aldeide
e ha bisogno di un mediatore; il mediatore d''altra parte ossida l''aldeide solo in forma ossidata di
ossammonio e comunque essendo presente in forma substechiometrica ha bisogno di essere rigenerato e
necessita quindi di far parte di un ciclo catalitico ossidativo. Successivamente ci siamo concentrati sullo studio dell''ossidazione degli altri 2-aril propanoli (testati in forma
racema) precursori dei Profeni. Tutte le prove sono sempre state effettuate utilizzando il TEMPO al 20%,
gorgogliando l''ossigeno e mantenendo chiuso il sistema ma con una quantità di enzima utilizzato doppia
rispetto al 2 fenil propanolo unitamente ad una quantità doppia di solvente utilizzato.
L''ibuprofenolo, il fenoprofenolo e il ketopronolo e ketroprofendiolo (Tabella 15, entries 1-4) hanno portato
ad ottime rese in acido in sola acqua milliQ; il dato è molto interessante se si considerano i tempi
relativamente brevi di reazione (3 giorni al massimo per il feno profenolo e il ketoprofendiolo) e il fatto che
gli alcoli non sono solubili se non in minima parte in acqua. Per il flurbiprofenolo la stessa reazione condotta
in acqua ha portato ad una resa del 35% (Tabella 15, entry 13) dopo quattro giorni mentre per il
naprossenolo è stato necessario usare cosolventi. L''utilizzo di cosolventi organici e/o surfattanti ha infatti
portato a buone rese pe entrambi gli alcoli. Tabella 15
I migliori cosolventi sono stati la DMF, il THF e l''acetone al 10% per il naprossenolo (Tabella 15, entries 10-
12) ) e il DMSO per il flurbiprofenolo (Tabella 5, entry 15). E'' interessante notare come il miglior risultato per
entrambi sia in effetti stato ottenuto utilizzando il TRITON X-100, un surfattante non ionico (Tabella 15,
entries 9 e 18).
Tuttavia gli acidi ottenuti non riuscivano ad essere separati dal surfattante se non probabilmente con una
separazione su colonna a scambio ionico (una DOWEX). Per verificare la robustezza del protocollo così ottimizzato per ogni alcol aril propanoico, abbiamo deciso di
effettuare uno scale up nelle condizioni migliori, partenzo però dalprofenolo enantiomericamente puro per
verificare contemporaneamente la configurazione dell''acido ottenuto.
In tutte le prove effettuate è stato ottenuto l''acido in ottime rese e con eccessi enantiomerici sempre
superiori al 99%.

Questo risultato ha dimostrato come il protocollo sia applicabile anche su quantitàdi alcol maggiore; inoltre
soprattutto le condizioni di reazione non portano mai a fenomeni di racemizzazione, avendo l''unico
enantiomero dell''acido ottenuto una configurazione identica all''alcol di partenza.
La racemizzazione è tanto più facile quanto più il pK del protone in α del composto carbonilico è basso, in
quanto la deprotonazione porta all''enolo, il quale può essere nuovamente protonato dalla faccia Re e Si. Nel
nostro caso l''enolo che si forma è anche molto stabile termodinamicamente, essendo coniugato con l''anello
aromatico. Nel nostro sistema sia l''aldeide che l''acido carbossilico possono enolizzare, ma l''aldeide ha un
protone in α più acido e racemizza più velocemente. La racemizzazione è molto più veloce a pH basici ma il
pH dell''acqua milliQ è definibile come neutro ma progressivamente tende ad acido per via della formazione
dell''acido carbossilico. Visto che l''acido che si forma è enantiomericamente puro sembra sperimentalmente
dimostrato che non interviene alcun fenomeno di enolizzazione o avviene solo in una percentuale
indeterminabile. L''aldeide intermedia quindi viene subito idratata e successivamente ossidata, invece di
equilibrarsi con l''enolo e racemizzare. H O H OH R R H O R H O R RACEMIZZAZIONE ENOLIZZAZIONE OH OH R O OH R OSSIDAZIONE IDRATAZIONE
Gli ottimi risultati ottenuti con i Profeni ci hanno spinto ad estendere il protocollo alla ossidazione ad acido
carbossilico di altri alcoli. L''utilizzo delle laccasi in letteratura nell''ambito delle ossidazioni, come
precedentemente citato, propende per l''ossidazione di alcoli primari ad aldeidi e secondari a chetoni.
Tuttavia il nostro protocollo sugli alcoli 2-aril propanoici sembra dimostrare che è possibile per gli alcoli
primari anche ossidarsi ad acidi carbossilici. Se come dimostrato l''ossidazione delle aldeidi passa tramite
l''idrato, sembra che la facilità con cui un''aldeide si idrati (definibile come pKHYD) sia la forza guida.
L''idratabilità di un centro carbonilico dipende da tre fattori:

- solubilità dell''aldeide in acqua (accesso ciò del gruppo carbonilico al ''suo reagente');
- elettrofilia del centro carbonilico;
- ingombro sterico dei gruppi carbonilici.

Abbiamo quindi effettuato le nostre prove preliminari sui seguenti alcoli.
OH OH OH HO OH MeO OH Cl OH N OH N OH N OH O OH OH OH OH OH OH OH OH Cl Cl Cl OH Cl Cl OH Cl NO2 O2N OH
Gli unici alcoli che hanno portato alla formazione di acido sono stati il 2-4 dinitrobenzil alcol, i piridin
metanoli e il 2-fenil etanolo. Tutti gli altri substrati non hanno reagito o hanno portato solamente alla
formazione di aldeide. A tuttora è difficile interpretare e giustificare i risultati ottenuti e gli studi relativi a
questo aspetto sono ancora in corso


2.5 Parte Sperimentale

Parte sperimentale relativa al paragrafo 2.3.1

Procedura Generale per la riduzione enzimatica:
Metodo con NADH Stechiometrico
Into a vial equipped with a magnetic stirrer (double spinfin magnetic stirring bar) all reagents were added in
the following order: 0.5 mL of a 5 mM solution of the starting aldehyde in CH3CN or THF, 0.5 mL of a 10 mM
solution of NADH freshly prepared in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5), 0.1M phosphate buffer (pH 7.5) to
reach a total final volume of 5 mL and the chosen amount of enzyme from a freshly prepared solution in
phosphate buffer. In the case of co-solvent absence, the aldehyde was directly added to the reaction mixture.
In the case of enzymatic reductions in hexane, data were obtained by adding solid lyophilized cofactor
together with lyophilized enzyme into the reaction vessel before adding the solvent mixture and the
substrate. Et2O

Metodo con il riciclo del NADH
Into a vial equipped with a magnetic stirrer (double spinfin magnetic stirring bar) all reagents were added in
the following order: 1.5mLof a 5mMsolution of the starting aldehyde in CH3CN or THF, 0.45 mL of EtOH, 1.5
mL of a 0.1 mM solution of NADH freshly prepared in the appropriate 0.1 M buffer, 0.1M buffer to reach a
total final volume of 15 mL and the chosen amount of enzyme froma freshly prepared solution in buffer. In
the case of co-solvent absence, 2-arylpropanals were diluted in EtOH.

Metodo semipreparativo
Into a flask equipped with a magnetic stirrer were added in the following order: 0.5 mmol of the starting
aldehyde 1a,c''d in 10 mL of CH3CN, 3.4 mL of EtOH and phosphate buffer 0.1 M (pH = 8) to reach a final
total volume of 100 mL. After 15 min NADH (0.01 mmol, 7.1 mg) and the enzyme (1 mg, 0.46 U/mg) were
added to the solution. After 96 h the reactions were worked up by adding 1 g of solid NaCl to the aqueous
phase and extracting 3 times with EtOAc (3 ¥ 75 mL). The organic phases were dried over Na2SO4 and
concentrated in vacuo. Yields after flash chromatography (80/20 cyclohexane/ethylacetate). Oxidation to 2-
arypropionic acids is reported in the ESI. Formation of arylpropanols was monitored by inverse phase HPLC
analysis: at different reaction times, aliquot samples were filtered, diluted and directly injected. Calibration
curves obtained with pure arylpropanols (five dilutions, each in triplicate) were used for quantitative analysis.
Enantiomeric ratios were determined by HPLC analysis on chiral columns.

Sintesi delle aldeidi aril propioniche (1b-1f)

Metodo 1 (Si considera come esempio generale la sintesi della ibuprofenale 1b)
Racemic 2-(4-isobutylphenyl)-propanoic acid, Ibuprofen, (30 mmol, 6.2 g) was refluxed in EtOH (50 mL) in
the presence of a catalytic amount of BF3.Et2O (0.5 mL). At disappearance of the starting carboxylic acid, the
solvent was concentrated, the crude dissolved in EtOAc (50 mL) and washed with aqueous NaHCO3, the
organic phase was concentrated furnishing ethyl 2-(4-isobutylphenyl)-propanoate in 80% yield. The ethyl
ester (25 mmol, 5.9 g) was then dissolved in Et2O (100 mL) at -78°C, then iBu2AlH (1M solution in hexane, 36
mL, 36 mmol) was added dropwise. Conversion was followed by GC, at completion the reaction mixture was
poured into a 2M aqueous solution of potassium sodium tartrate, diluted with Et2O (100 mL), vigorously
shaken until phase separation and re-extracted with Et2O (3' 50 mL). The combined organic phases were
dried and concentrated under vacuum. 2b is obtained as over-reduction-by-product in the same reaction. 1b
and 2b can be easily separated by flashchromatography and were obtained in 65% and 15% yield
respectively.

Metodo 2: (Si considera come esempio generale la sintesi della ibuprofenale 1b)
Racemic 2-(4-isobutylphenyl)-propanoic acid, Ibuprofen, (10 mmol, 2.06 g) was dissolved in Et2O (50 mL) at
0°C, then the complex BH3.Me2S (49 mmol, 4.6mL) was added dropwise. Conversion was followed by TLC, at
completion the BH3.Me2S in excess was carefully quenched with H2O, NaOH 2N (50 mL) was added and the
mixture was extracted with EtOAc (3' 50 mL) and concentrated affording 2b in 98% yield. In a flask charged
with a solution of oxalyl chloride (12 mmol, 1mL) in CH2Cl2 (100 mL) at -78°C, DMSO (22 mmol, 1.56 mL) was
added dropwise. After 10 minutes 2b (10 mmol, 1.9 g) was added and the mixture is stirred at -78°C for 1h then TEA was added (40 mmol, 5.58 mL). Conversion was followed by TLC, the reaction was quenched with a
saturated solution of NH4Cl, extracted with CH2Cl2 and
washed with NaHCO3. The organic phase was concentrated and 1b was obtained after purification by flash-
chromatography in 80% yield.

2-(4-isobutylphenyl)-propanal (Ibuprofenal) 1b: Obtained in 80% overall yields following method 1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.94 (d, J = 6.6 Hz, 6H, (CH3)2CH), 1.46 (d, J = 7.2 Hz,
3H, CH3CH), 1.89 (m, 1H,
(CH3)2CHCH2), 2.50 (d, J = 6.6 Hz, 2H, CH2), 3.64 (q, J = 7.2 Hz, 1H, CH3CH), 7.10-
7.21 (m, 4H, arom), 9.73 (s, 1H, CHO); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ 14.3, 22.1, 29.9, 44.8, 52.3, 127.8, 129.5, 134.6, 140.6, 200.8; IR: ν = 3433, 2950, 1722; elemental analysis calcd (%) for
C13H18O: C 82.06, H 9.53; found: C 82.01, H 9.58.

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-propionaldehyde (Flurbiprofenal) 1c. Obtained in 70% overall yields following method 1.
1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ 1.51 (d, J = 7.4 Hz, 3H, CH3), 3.70 (dq, J = 1.4, 7.4 Hz,
1H, CH), 7.01-7.11 (m, 2H, arom), 7.34-7.59 (m, 6H, arom), 9.73 (d, J = 1.4 Hz, 1H,
CHO); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): 14.2, 51.1, 115.8 (d, J(C,F) = 27 Hz), 124.1 (d,
J(C,F) = 3 Hz), 127.7, 127.9, 128.4, 128.7 (d, J(C,F) = 3 Hz), 131.1 (d, J(C,F) = 4 Hz),
135.1, 139.9 (d, 1C, J(C,F) = 8 Hz), 159.8 (d, 1C, J(C,F) = 248 Hz), 200.2; IR: ν =
3433, 3080, 3030, 1727; elemental analysis calcd (%) for C15H13FO: C 78.93, H 5.74; found: C 78.92, H 5.81.

2-(3-Phenoxy-phenyl)-propionaldehyde (Fenoprofenal) 1d. Obtained in 65% overall yields following method 1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.45 (d, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 3.62 (dq, J = 1.2,
7.2 Hz, 1H, CH), 6.91-6.9 8 (m, 3H, arom), 7.03-7.06 (m, 2H, arom), 7.12-7.17
(m, 1H, arom), 7.33-7.40 (m, 3H, arom), 9.69 (d, J = 1.2 Hz, 1H, CHO); 13C NMR
(75 MHz, CDCl3): δ 14.4, 52.7, 117.5, 118.5, 119.0, 122.9, 123.5, 129.7, 130.2,
139.6, 156.7, 157.9, 200.6; IR: ν = 3430, 3070, 3034, 1726, 1582, 1250; elemental analysis calcd (%) for C15H14O2: C 79.62, H 6.24; found: C 79.71, H 6.28.

2-(6-Methoxy-naphthalen-2-yl)-propionaldehyde (Naproxenal) 1e. Obtained in 80% overall yield following method 1. 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ 1.52 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 3.75 (dq,
J = 1.0, 7.0 Hz, 1H, CH), 3.92 (s, 3H, OCH3), 7.14-7.30 (m, 3H, arom), 7.60 (s,
1H, arom), 7.69-7.77 (m, 2H, arom), 9.74 (d, J = 1.2 Hz, 1H, CHO); 13C NMR
(50 MHz, CDCl3): δ 14.5, 52.8, 55.2, 105.6, 119.2, 126.6, 126.9, 127.6, 129.0, 129.1, 132.7, 133.8, 157.8, 201.0; IR: ν = 3350, 1720, 1606; elemental analysis
calcd (%) for C14H14O2: C 78.48, H 6.59; found: C 78.35, H 6.70.

2-(3-Benzoyl-phenyl)-propionaldehyde (Ketoprofenal) 1f: obtained in overall 50% yield following method 2. 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ 1.51 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 3.74 (dq, J = 1.0,
7.0 Hz, 1H, CH), 7.28-7.84 (m, 9H, arom), 9.74 (d, J = 1.0 Hz, 1H, CHO); 13C
NMR (50 MHz, CDCl3): δ 14.7, 52.8, 128.4, 128.9, 129.3, 129.7,
1 30.1, 132.2, 132.7, 137.4, 138.3, 196.4, 200.5; ; IR: ν = 3400, 3060, 1730,
1658, 1596 1317, 1281; elemental analysis calcd (%) for C16H14O2: C 80.65, H 5.92; found: C 80.58, H 5.96.

Ossidazione dei (2S)-arilpropanoli
Ossidazione di 2c e 2d
Solid KMnO4 (0.52 mmol, 82 mg) was added to a solution of (2S) - (2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-propan-1-ol 2c
obtained from enzymatic reduction (0.13 mmol, 30 mg) in acetone (1.5 mL) and H2SO4 3N (1.5 mL) at 0°C
under stirring. The solution was kept at 0° C for 4 more hours and at room temperature for 30 minutes.
Conversion was followed by TLC. The reaction was diluted by adding 5 mL of HCl (1N) and solid Na2SO3 until
the discolouring of the solution. The aqueous phase was extracted twice with EtOAc (2 x 10 mL), the organic
phase was then extracted with a 2% NaOH solution (2 x 10 mL). The collected acqueos phase was acidified to
pH 1 with HCl (2N) and extracted twice with CH2Cl2 (2 x 10 mL). The final organic phase was dried over
Na2SO4 and concentrated in vacuo obtaining 15 mg of Flurbiprofen as a light yellow oil in 46 % yield. [α]20
D = +37.2 (c = 1, CHCl3); lit. data of (S)- Flurbiprofen [α]20 CHO CHO F CHO O CHO O CHO MeO D = +42 (c = 1, CHCl3) 200
Ossidazione di 2d
Solid KMnO4 (0.88 mmol, 139 mg) was added to a solution of (2S) -2-(3-phenoxy-phenyl)-propan-1ol 2d
obtained from enzymatic reduction (0.22 mmol, 50 mg) in acetone (2 mL) and H2SO4 3N (2 mL) at 0°C under
stirring. The solution was kept at 0° C for 4 more hours and at room temperature for 30 minutes. Conversion
was followed by TLC. The reaction was diluted by adding 5 mL of HCl (1N) and solid Na2SO3 until the
discolouring of the solution. The aqueous phase was extracted twice with EtOAc (2 x 10 mL), the organic
phase was then extracted with a 2% NaOH solution (2 x 10 mL). The collected aqueous phase was acidified to
pH 1 with HCl (2N) and extracted twice with CH2Cl2 (2 x 10 mL). The final organic phase was dried over
Na2SO4 and concentrated in vacuum obtaining 25 mg of Fenoprofen as a light yellow oil in 47 % yield. [α] 20 D = +36.5 (c = 2, CHCl3); lit. data of (S)- Fenoprofen [α]20
D = +46 (c = 1, CHCl3) 201
Determinazione dell''eccesso enantiomrico degli alcoli e assegnazione della configurazione del maggior
stereoisomero
Enantiomeric ratios were determined by HPLC analysis on chiral columns. In the case of alcohols 2a, 2b, 2e
and 2f the (S) configuration of the major isomer was established by direct comparison with commercial (S) 2-
phenylpropanol or (S) alcohols, obtained by reduction with BH3.Me2S of the commercial (S) acids. For 2c and
2d the (S) configuration of the major isomer was established by converting the alcohols obtained in the
semipreparative procedure into acids by oxidation with KMnO4 and comparing the optical rotation with
reported data.

HPLC chirale degli alcoli: condizioni
2a-f on Daicel chiral columns.
Rt(min) Rt (min) Column, hexane/iPrOH (0.5 mL/min)
2a) 13.2 (R) 15.6 (S) OF, 93/7 isocratic analysis
2a) 38.2 (R) 39.4 (S) OD, 99/1 isocratic analysis
2b) 10.6 (R) 11.9 (S) OF, 94/6 isocratic analysis
2c) 13.9 (S) 16.5 (R) OD, 89/11 isocratic analysis
2d) 22.1 (S) 23.9 (R) OF, 95/5 isocratic analysis
2e) 16.4 (S) 17.3 (R) OD, 94/6-80/20 in30 min
2f )43.6 (S) 44.8 (R) OF, 97/3-93/7 in 20 min then 60/40 in 50 min

2-(4-Isobutylphenyl)-propanol (Ibuprofenol) 2b. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 0.92 (d, J =6.6, 6H, (CH3)2CH), 1.28 (d, J = 7.2, 3H,
CH3CH), 1.4 (bs, 1H, OH), 1.86 (m, 1H, (CH3)2CHCH2), 2.46 (d, J = 7.2, 2H, CH2),
2.93 (sextet, J = 7.2, 1H, CH), 3.70 (d, J = 7.2, 2H, CH2OH), 7.10''7.17 (m, 4H,
arom); 13C NMR (75MHz, CDCl3): d 17.5, 22.2, 30.0, 41.8, 44.8, 68.4, 127.0, 129.0, 139.6, 140.9; IR: n = 3372, 1684, 1513, 1465; elemental analysis calcd (%) for C13H13O: C 81.20, H
10.48; found: C 81.15, H 10.52.

2-(2-Fluoro-biphenyl-4-yl)-propan-1-ol (Flurbiprofenol) 2c.
1H NMR (200 MHz, CDCl3): d 1.34 (d, J = 7.0, 3H, CH3), 1.57 (bs, 1H, OH), 3.02
(sextet, J = 7.0, 1H, CH), 3.77 (d, J = 7.0, 2H, CH2), 7.05''7.16 (m, 2H, arom),
7.28''7.61 (m, 6H, arom); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): d 17.4, 41.9, 68.4, 114.9
(d, J(C,F) = 23), 123.5 (d, JC,F = 3), 127.2 (d, 1C, JC,F = 18), 127.5, 128.4, 128.9
(d, JC,F = 3), 130.7 (d, J(C,F) = 4), 135.7, 145.5 (d, 1C, JC,F = 7), 159.9 (d, 1C, JC,F
= 247); IR: n = 3373, 1023; elemental analysis calcd (%) for C15H15FO: C 78.24, H 6.57; found: C 78.19, H 6.56. (S)-2c obtained from semi-preparative enzymatic reaction: [a]20 D = -11.5, (c
= 2.6, CHCl3).

2-(3-Phenoxy-phenyl)-propan-1ol (Fenoprofenol) 2d.
200 M. Allegretti, R. Bertini, M. C. Cesta, C. Bizzarri, R. Di Bitondo, V. Di Cioccio, E. Galliera, V. Berdini, A. Topai, G. Zampella, V. Russo, N. Di
Bello, G. Nano, L. Nicolini, M. Locati, P. Fantucci, S. Florio, F. Colotta, J. Med. Chem., 2005, 48, 4312-4331 201 L. Carde, D. H. Davies, M. R. Stanley, J. Chem. Soc., Perkin Transactions 1: Organic and Bio-Organic Chemistry, 2000, 15, 2455 '' 2464 OH F OH 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.30 (d, J = 7.2, 3H, CH3), 1.4 (bs, 1H, OH), 2.97
(sextet, J = 7.2, 1H, CH), 3.72 (d, J = 7.2, 2H, CH2), 6.89''7.19 (m, 6H, arom),
7.30''7.42 (m, 3H, arom); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): d 17.5, 42.2, 68.4, 116.7,
117.9, 118.8, 122.3, 123.2, 129.7, 145.9, 157.0, 157.4. IR: n = 3350, 1584, 1489, 1250; elemental analysis calcd (%) for C15H16O2: C 78.92, H 7.06; found: C 79.02, H 7.05. (S)-2d
obtained from semi-preparative enzymatic reaction: [a]20 D = -10.0 (c = 2.4, CHCl3).

2-(6-Methoxy-naphthalen-2-yl)-propan-1-ol (Naproxol) 2e. 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.38 (d, J = 7.0, 3H, CH3CH), 1.4 (bs, 1H, OH),
3.11 (sextet, J = 7.0, 1H, CH), 3.70 (d, J = 7.0, 2H, CH2), 3.94 (s, 3H, OCH3),
7.14''7.28 (m, 2H, arom), 7.34''7.40 (m, 1H, arom), 7.63''7.76 (m, 3H, arom);
13C NMR (50 MHz, CDCl3): d 17.6, 42.4, 55.3, 68.6, 105.6, 118.9, 125.9, 126.3, 126.2, 127.2, 129.1, 133.5, 138.7, 157.5; IR: n = 3300, 1604, 1028; elemental analysis calcd (%) for
C14H16O2: C 77.75, H 7.46; found: C 77.91, H 7.51.

[3-(2-Hydroxy-1-methyl-ethyl)-phenyl]-phenyl-methanone (Ketoprofenol) 2f.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): d 1.35 (d, J = 7.0, 3H, CH3CH), 1.4 (bs, 1H, OH),
3.07 (m, 1H, CH), 3.79 (d, J = 6.6, 2H, CH2), 7.44''7.86 (m, 9H, arom);
13CNMR(75MHz, CDCl3): d 17.6, 42.3, 68.5, 128.3, 128.4, 128.6, 128.9, 130.0,
131.7, 132.4, 137.6, 137.8, 144.2, 196.8; elemental analysis calcd (%) for
C16H16O2: C 79.97, H 6.71; found: C 80.05, H 6.69. Parte Sperimentale relativa al paragrafo 2.3.2

Biologia
Materials, strains, vectors and culture conditions
All chemical reagents, unless otherwise stated, were purchased as analytical grade from Sigma-Aldrich or TCI
and used without further purification. Aldehydes were commercial or prepared as reported. Alcohols were
commercial or prepared from the corresponding aldehydes by reduction with NaBH4 in methanol. All spectra
were consistent with reported data. NAD + was purchased from Apollo Scientific Ltd, Stockport, U.K. Staining and de-staining was performed using the Stain/DeStain-Xpress protein detection kit (Enzolve Technologies.,
Ltd., Ireland). E. coli BL21 competent cells were purchased from Novagen (Germany). Transformed E.coli
strains were generally cultured in Luria-Bertani (LB) agar and in LB broth, both containing ampicillin (100
μg/mL) at 37°C, shaking at 250 rpm. E.coli strains harbouring a pRSETb-EqADH-E vector were cultured in PG
(minimal media) agar and in Auto Induction broth, both containing ampicillin (100 μg/mL) at 37°C, shaking
at 250 rpm. 46 Sepabeads EC-EP/S were kindly donated by Resindion SRL (Binasco, Milan, Italy).
Morphological investigation was carried out with a Philips XL-20 Scanning Electron Microscope operating at
15kV coupled with Energy-Dispersive X-ray Spectrometer. Samples were air-dried, then sputter-coated with
carbon 60s prior to examination.

Expression and purification of His-HLADH-EE
His-HLADH-EE gene inserted in vector pRSETb was expressed and the protein purified as previously
reported. 202 Crude protein concentration was determined by Bradford protein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories GmbH, Germany) with bovine serum albumin as a standard. Pure protein concentrations were
determined by UV absorption at 280 nm using the absorbitivity reported in the literature (0.441 mL/(mg cm)
for His-HLADH-EE) 203
Immobilizzazione dell''enzima HLADH su biglie di vetro:
1)Lavaggio biglie: Lavare le biglie di vetro da 0.5 mm di diametro con una soluzione di NH3 30% v/v , H2O2
30% v/v, H2O in rapporto 1:1:4 a temperatura ambiente, filtrarle e sciacquarle con acqua Milli-Q. Metterle a
reagire con una soluzione di HCl 30% v/v , H2O2 30% v/v, H2O in rapporto 1:1:4, e scaldare la miscela a 85-
90°C per 1 ora. Al termine, lascare raffreddare la miscela, filtrare le biglie, sciacquarle abbondantemente
con acqua Mill-Q ed asciugarle a 50°C sotto vuoto. (In caso di stoccaggio tenere le palline in frigo in
etanolo).2)Procedura generale per la sililazione delle biglie.Pesare la quantità di palline desiderate, per es. 2
203 Bradford, MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248-254. O OH O OH MeO OH grammi. Sotto azoto, in un pallone a 2 colli mettere 5 ml di toluene anidro ed aggiungere in successione 100
µl di γ-APTES (γ-amminotrimetossisilano) e le biglie. Lasciare sotto agitazione e a riflusso la reazione per 18-
24 ore. Al termine, lasciare raffreddare, filtrare le palline e lavarle con toluene. Anidrificare sotto vuoto a
110°C per circa 3 ore per completare la sililazione. In caso di stoccaggio, lasciare le palline in frigo immerse in
metanolo (stabili per 15-20 giorni); 3)Procedura generale per l''attacco ammidico tra le biglie e l''anidride
succinica. Prendere 2 gr di palline di vetro e metterle in un pallone a due colli, sotto azoto. Aggiungere 2 ml
di diossano anidro. Sotto agitazione, gocciolare 200 mg di anidride succinica in 2 ml di diossano e scaldare la
reazione per 60 minuti a 80°C. Lasciare raffreddare (l''anidride succinica non reagita dovrebbe riprecipitare
raffreddando) e filtrare le biglie e lavarle con CH3CN per togliere l''anidride non reagita. Lasciare le palline
filtrate in frigo (usarle entro pochi giorni); 4)Procedura di coupling enzimatico: Prelevare la quantità voluta di
palline (es. 200 mg) e metterle in una fiala. Pesare 2.0 mg di EDC e scioglierla in 1 ml di tampone pH 5, 0.1M.
Aggiungere immediatamente la carbodimmide alle palline e sonicare la miscela a temperatura ambiente per
30 minuti. Filtrare le palline e lavarle più volte con la soluzione tampone. Mettere le palline in una nuova
fiala ed aggiungere la soluzione di enzima in buffer preparato precedentemente (per es. 1 ml di soluzione
per 200 mg di palline). Sonicare la reazione per 30 minuti tenendo il bagno sonicante intorno ai 4-10°C.
Prelevare la soluzione e travasarla in una eppendorf per le misure successive ed aggiungere una quantità
nota di buffer (es. 1 ml) alle palline, sciacquare e travasare il liquido in una nuova eppendorf (per prelevare
completamente l''enzima che non si è attaccato).

Immobilizzazione su Resina Stratosfere ® dell''enzima His-HLADH-EE
100 mg di resina (circa 0.5 mmol) vengono sospesi in 15 mL di acqua milliQ e successivamente vengono
aggiunti 3 equivalenti di sale; il tutto viene lasciato ad agitare su orbital shaker a 120 rpm per 24 ore. La
resina viene poi accuratamente lavata e si procede al coupling enzimatico mettendola in contatto con una
soluzione di His-HLADH-EE.
Resina derivatizzata:
100 mg di resina (circa 0.5 mmol) vengono sospesi in 15 mL di Metanolo e vengono aggiunti 1.1 equivalenti
di aldeide salicilica. Dopo 4 ore, il metanolo viene separato, viene aggiunta acqua milliQ (15 mL) e
successivamente vengono aggiunti poi 3 equivalenti di sale; il tutto viene lasciato ad agitare su orbital shaker
a 120 rpm per 24 ore. La resina viene poi accuratamente lavata e si procede al coupling enzimatico
mettendola in contatto con una soluzione di His-HLADH-EE.

Immobilizzazione su Resina Epossidica trattata dell''enzima His-HLADH-EE
If not otherwise stated, the following procedure was adopted. Sepabeads EC-EP/S were derivatized with
iminodiacetic acid (IDA) and CoCl2 following the procedure reported in literature by Guisan, allowing a
modification of around 5% of the epoxy-groups in the support 204211 g of beads was shaken at room temperature for two hours in 2 mL of support modification buffer (0.1 M sodium borate, 2 M iminodiacetic
acid, pH 8.5). The derivatized resin, rinsed with double distilled water, was then resuspended in 5 mL of
metal containing solution (0.05 M sodium phosphate buffer pH 6.0, 1.0 M NaCl and 5 mg/mL of CoCl2) and
shaken at room temperature for 2 hours. The resin, rinsed again with double distilled water, was then put in
contact with His-HLADH-EE (1 mg of enzyme per 1 g of resin, if not otherwise stated) and the mixture was
gently shaken at room temperature over 24 hours. The resin was then thoroughly washed using a desorption
buffer (20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, 50 mM EDTA, 0.5 M NaCl, pH 7.4, as per IMAC purification
procedure)(Quaglia et al., 2012) and water to achieve complete removal of the cobalt first and of the
residual EDTA after. The un-reacted epoxides were neutralised using a blocking buffer (3 M glycine, pH 8.5, 4
mL per g of beads) over 20 hrs at room temperature, with gentle shaking. The immobilized enzyme was
thoroughly washed and routinely stored in buffer (Tris-HCl, pH 8.5). To achieve immobilization using
different metals the following salts were used: NiCl2 x 6H2O, CuSO4 x 5H2O (5 mg/mL, 5 mL for 1 g of beads,
allowing a 2hrs contact with the derivatized beads). The metal solutions were prepared using buffer 50mM
Na2HPO4-NaH2PO4, pH 6.0. Immobilization has been performed on purified enzyme, if not otherwise stated.

Saggi di attività
Spectrophotometric activity measurements were based on the substrate-dependent absorbance change of
NADH at 340 nm and routinely done in reaction mixtures (1 mL for the soluble enzyme and 5 mL for the
immobilized) at 25 °C, using a Varian Cary 50 Scan UV-visible spectrophotometer equipped with a Cary single
cell Peltier temperature controller. For the immobilized enzyme the reaction mixture was shaken at 25 °C,
204 Pessela BCC, Mateo C, Carrascosa AV, Vian A, García JL, Rivas G, Alfonso C, Guisan JM, Fernández-Lafuente., Biomacromolecules 2003; 4:107-113.
250 rpm and the absorbance at 340 nm was recorder every minute as single readings. To test the
recyclability of the enzyme after each cycle (9 minutes in total duration) the resin was washed thoroughly
with buffer and a new reaction was set up. Unless otherwise stated, the reaction mixture for the oxidative
step contained NAD + (1 mM), ethanol (4 mM), enzyme sample (appropriate amount) and up to 1 mL of 0.1 M sodium pyrophosphate buffer, pH 8.8. The buffer was equilibrated at 25 °C prior to the assay. One unit of
HLADH corresponded to the amount of enzyme required to reduce 1 μmol of NAD + per min at 25 °C. For the pH stability test the following buffers were used: 50 mM Na2HPO4-NaH2PO4 buffer pH 6.5, 50 mM Tris-HCl pH
8.5. To investigate the optimum pH of reaction the following buffers were used: 50 mM Na2HPO4-NaH2PO4
buffer pH 6.5, 7.5, 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.5, 0.1 M pyrophosphate buffer or 50 mM Glycine-NaOH
buffer pH 8.8, 50 mM Glycine-NaOH buffer pH 9.5, 10.5, 50 mM Na2HPO4-NaOH buffer pH 11.0, 11.5. 50 mM
Glycine-NaOH buffer, 50 mM KCl-NaOH buffer pH 12.5.
pH 9.5 was used to investigate the optimum reaction temperature and temperatures between 25 and 55 °C
were tested. The pH values of the buffers were always adjusted at the temperature at which the experiment
was carried out. To test the stability at different solvents the enzymes were incubated in 10 (free enzyme)
and 20 % (free and immobilized enzymes) of solvent (CH3CN, THF, DMSO and methanol were used) in 50 mM
Tris-HCl, pH 8.5 buffer. The activity was recorded at time zero and after 24 hours in the usual conditions. To
test the inactivation upon contact with metals, the enzyme was incubated at room temperature for 24 hours
in a 3.5 mM metal solution (maximum concentration if total leaching occurred). Samples with different
metals (CoCl2, NiCl2 and CuSO4) were checked for activity over 24 hours and compared to a control sample.

Chimica
General procedure for enzymatic reduction of aldehydes
Metodo A
Into a vial stirred on an orbital shaker (140 rpm) all reagents were added in the following order: 0.5 mL of a
5mM solution of the starting aldehyde in CH3CN, 0.146 mL of EtOH, 0.5 mL of a 0.1 mM solution of NADH
freshly prepared in the appropriate 0.1 M buffer, 0.1 M buffer to reach a total final volume of 5 mL and the
chosen amount of enzyme.

Metodo B:
Biphasic system: into a vial stirred on an orbital shaker (140 rpm) all reagents were added in the following
order: 2.5 mL of a 5 mM solution of the starting aldehyde in the organic solvent, 0.146 mL of EtOH, 0.5 mL of
a 0.1 mM solution of NADH freshly prepared in the appropriate 0.1 M buffer, 0.1 M buffer to reach a total
final volume of 5 mL and the chosen amount of enzyme.

Immobilized enzyme recycling.
Into a vial stirred on an orbital shaker (140 rpm) all reagents were added in the following order: 0.5 mL of a
5mM solution of the starting aldehyde in CH3CN, 0.146 mL of EtOH, 0.5 mL of a 0.1 mM solution of NADH
freshly prepared in the appropriate 0.1 M buffer, 0.1 M buffer to reach a total final volume of 5 mL and the
chosen amount of enzyme. After the conversion of the starting aldehyde the solution was removed and the
enzyme was gently washed with the same buffer (3 x5 mL). The enzyme was reused for the reaction with the
same starting conditions.

Analisi dei prodotti
Formation of arylpropanols and alcohols was monitored by reverse phase HPLC or GC-FID analysis: at
different reaction times, aliquot samples were filtered, diluted and directly injected.
Method 1: reverse phase HPLC on Agilent Technology HP1100, column ZORBAX-Eclipse XDB-C8 5 µm, 4.6 x
150 mm Agilent Technologies. The compounds were eluted with CH3CN''H2O, flux 0.5 mL min-1. Method 1,:
50% of CH3CN and 50% of H2O in 25 min.
Method 2: reverse phase HPLC on Agilent Technology HP1100, column ZORBAX-Eclipse XDB-C8 5 µm, 4.6 x
150 mm Agilent Technologies. Eluition program from 70% to 100% of CH3CN in 15 min, then 100% of CH3CN
for 10 min T = 30 'C: Method 3, for alcohols 2i and 2h, GC-FID Agilent Technologies 6890 using gradient
from 50° to 280°C over 30 min, column HP5 5%Ph-Me silicon.
Calibration curves (five dilutions, each in triplicate) were used for quantitative analysis of arylpropanols,
while for the other alcohols the reaction was evaluated by the disappearing of the starting aldehyde.
Enantiomeric ratios of 2-arylpropanols were determined by HPLC analysis on chiral columns.

Parte Sperimentale relativa al capitolo 2.4.1
Procedure Generali per l''ossidazione degli arilpropanoli 2a-h a acidi 4a-f
Metodo di ossidazione con KMnO4
Solid KMnO4 (0.88 mmol, 139 mg) was added to a solution of (2S)-phenyl-propanol 1a in acetone (2 mL) and
H2SO4 3 N (2 mL) at 0 °C under stirring. The solution was kept at 0 °C for 4 more hours and
at r.t. for 30 min. Conversion was followed by TLC. The reaction was diluted by adding 5 mL of HCl (1 N) and
solid Na2SO3 until the discoloring of the solution. The aqueous phase was extracted twice with EtOAc (2 ' 10
mL), the organic phase was then extracted with a 2% NaOH solution (2 ' 10 mL). The collected aqueous
phase was acidified to pH 1 with HCl (2 N) and extracted twice with CH2Cl2 (2 ' 10 mL). The final organic
phase was dried over Na2SO4 and concentrated in vacuum obtaining acid 2a in 36% yield.

Metodo di ossidazione con la procedura di Noyori
In a round-bottom flask fitted with a water condenser the following reagents were added: alcohol (3.65
mmol, 0.5 mL), Aliquat 138 (2%, 0.07 mmol, 29 mg), KHSO4 (2%, 0.07 mmol, 20 mg), Na2WO4·2 H2O (2%,
0.07 mmol, 24 mg), and H2O2 (2 mL, 30% soln). The solution was kept at 90 °C, and the reaction progress
was followed by GC. The solution was then cooled to r.t. and 10 mL of a 10% Na2CO3 aq solution were
added followed by extraction with EtOAc (2 ' 10 mL). After concentration in this organic phase unreacted
alcohol and byproducts could be isolated. The aqueous phase were then acidified with diluted HCl until pH 2
and re-extracted with EtOAc (2 ' 10 mL). After evaporation pure acid could be obtained.

Metodo di ossidazione di Zhao
To a stirred solution of alcohol 1a''h (0.4 mmol) in MeCN (2 mL) the following reagents were added: a
solution of NaClO2 (0.8 mmol, 85 mg) in H2O (0.4 mL), TEMPO (0.008 mmol), 0.67 M phosphate buffer pH
6.7 (1.5 mL), and a solution of commercial household bleach (5.25% in NaClO, 10.6 mL) in H2O (0.2 mL). The
temperature was maintained at the values reported in Table 2 with a silicon oil bath. The conversion was
monitored by TLC and further portions of TEMPO/NaClO/NaClO2 (0.008:0.4:0.008 mmol ratios) were
eventually added as reported in the Tables. When the reaction was complete (TLC monitoring) it was
quenched at 0 °C by adding H2O (3 mL), aq sat. solution of NaHCO3 till pH 8 and Na2SO3 (1.4 mmol, 183 mg).
After a 30 min stirring, EtOAc (2 mL) was added, and the solution was stirred for further 15 min. The organic
layer was separated and discharged. HCl (1 N) was then slowly added at 0 °C till pH 2 to the aq solution
which was then extracted with EtOAc (2 ' 5 mL). The collected organic phases were washed with brine, dried
over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford 2-arylpropionic acids pure by HPLC or NMR
analysis.

Eccessi enantiomerici degli acidi 4a-f ottenuti
Enantiomeric ratios of acids 2a''h were determined by HPLC analysison chiral columns, configuration of the
major isomer was established by direct comparison with commercial products or by comparing the optical
rotation with reported data.
4a) tR = 5.5 min (R), 6.0 min (S), Daicel AD, hexane''i-PrOH (92:8), TFA 0.1%, 1 mL/min.
4b) tR = 7.9 min (R), 8.9 min (S), Daicel OD, hexane''i-PrOH (98:2), TFA 0.1%, 1 mL/min.
4c) tR = 6.2 min (R), 8.0 min (S), Daicel AD, hexane''i-PrOH (90:10), TFA 0.1%, 1 mL/min.
4d) tR = 6.8 min (R), 8.0 min (S), Daicel AD, hexane''i-PrOH (90:10), TFA 0.1%, 1 mL/min.
4e) tR = 10.8 min (R), 11.8 min (S), Daicel AD, hexane''i-PrOH (90:10), TFA 0.1%, 1 mL/min.
4f) tR = 12.9 min (R), 15.3 min (S), Daicel AD, hexane''i-PrOH (90:10), TFA 0.1%, 1 mL/min.

Parte Sperimentale relativa al capitolo 2.4.2
Ossidazione del 2-fenilpropanolo 2a ad acido 4a
To a stirred solution of the chiral alcohol (1 mmol) in the appropriate solvent (10 mL) in a 50 mL flask were
added TEMPO (0.2 mmol), and the enzyme (10 mg) and then O2 was bubbled for 30 seconds. The solution
was stirred on an orbital shaker at 150 rpm, kept at room temperature and the reaction was monitored by
TLC. When the reaction was complete an aqueous saturated solution of NaHCO3 at 0° C was added to the
flask and 20 mL of DCM. The organic layer was separated and discarged then HCl (1N) was then slowly added
at 0 °C till pH 2 to the aqueous solution which was then extracted with DCM (3x15 mL). The collected organic
phases were dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford 2-arylpropionic acids pure by
NMR analysis and chiral HPLC.

Ossidazione degli alcoli 2b-f ad acidi 4b-f
To a stirred solution of the chiral alcohol (1 mmol) in the appropriate solvent (20 mL) in a 50 mL flask were
added TEMPO (0.2 mmol), and the enzyme (20 mg) and then O2 was bubbled for 30 seconds. The solution was stirred on an orbital shaker at 150 rpm, kept at room temperature and the reaction was monitored by
TLC. When the reaction was complete an aqueous saturated solution of NaHCO3 at 0° C was added to the
flask and 20 mL of DCM. The organic layer was separated and discarged then HCl (1N) was then slowly added
at 0 °C till pH 2 to the aqueous solution which was then extracted with DCM (3x15 mL). The collected organic
phases were dried over Na2SO4, filtered, and concentrated in vacuo to afford 2-arylpropionic acids pure by
NMR analysis and chiral HPLC.





















3
α-Amminonitrili

3.1 α-Amminonitrili: reattività e sintesi
Gli α-amminonitrili sono precursori versatili per la sintesi di molte molecole tra cui α-amminoacidi 205, 1,2- diammine, 1,2-amminoalcoli e molti altri composti contenenti l'atomo di azoto.
L''importanza di questi composti deriva dal loro carattere bifunzionale, la presenza cioè del gruppo amminico
e del gruppo ciano. Questa caratteristica ha portato gli α-amminonitrili ad essere grande oggetto di studio e
a classificarsi come intermedi sintetici importanti nella preparazione di diverse tipologie di. L'interesse della
ricerca si è quindi focalizzato sulle strategie di sintesi degli α-amminonitrili, soprattutto però come precursori
di nuovi α-amminoacidi.
Tali molecole subiscono le reazioni tipiche delle ammine e dei nitrili in generale e qualora entrambi i gruppi
funzionali siano suscettibili della stessa reazione è necessario, dove possibile, ricorrere all'ausilio di
opportuni gruppi protettori.
R' R'' NH2 CN R' R'' NH2 COOH R' R' NH2 R' R'' NH2 NH2 OH -amminoacidi 1,2-diammine 1,2-amminoalcoli
3.1.1 Reazioni degli α-amminonitrili
a) N-acilazione 206 Gli α-amminonitrili primari e secondari subiscono la N-acilazione in presenza di un agente acilante. Un
esempio di impiego è rappresentato dalla sintedi di uree simmetriche per trattamento di un α-amminonitrile
primario con etilcloroformiato o diossido di carbonio: R' R' NH2 CN Cl OEt O N H N H O CN R' R'' R' NC R'' (CO2)
b) N-alchilazione
L'atomo di azoto degli α-amminonitrili può essere alchilato per reazione con gli alogenuri alchilici. Un
esempio è la quaternarizzazione di un α -amminonitrile terziario: N CN R1 R2 R3 R4 R5X N CN R1 R2 R3 R4 Pr-OH / O R5
205 C. Najera,J. M. Sansano, Chem. Rev. 2007, 107, 4584; A. Perdih, M. S.Dolenc, Curr. Org. Chem. 2007, 11, 801. 206 Shafran, Y. M.; Bakulev, V. A.; Mokrushin, V. S. "Synthesis and properties of α-aminonitriles". Russ. Chem. Rev., 1989, 58 (2), 148-162; Opatz, T.
"The chemistry of Deprotonated α-Aminonitriles". Synthesis, 2009, 12, 1941-1959 ; D. Enders, J. P. Shilvock,Chem. Soc. Rev. 2000, 29, 359''373. La reazione tra le ammine primarie o secondarie e gli alogenuri alchilici non è utilizzata spesso in quanto il
problema della polialchilazione porta alla formazione di miscele di ammine e sali di ammonio con diversi
gradi di alchilazione dell'azoto.

c) Reazioni con agenti ossidanti
Le ammine primarie trattate con il perossido di idrogeno, i perossiacidi o altri agenti ossidanti, sono ossidate
in sequenza ad idrossilammine, a nitroso composti ed a nitro composti. Le ammine secondarie e terziarie
sono ossidate rispettivamente ad idrossilammine secondarie ed a ossidi. L'ossidazione degli α-amminonitrili
primari con gli ipocloriti dei metalli alcalini in un solvente organico dà gli azobisnitrili. R2 NH2 R1 CN ClO- R2 N R1 N C N R1 R2 C N d) Idrolisi del gruppo CN
La reazione sicuramente più importante degli α- ammino nitrili è l''idrolisi del gruppo ciano ad acido
carbossilico con l''ottenimento di α-amminoacidi. Questo procedimento rappresenta sicuramente una delle
più importanti applicazioni sintetiche di queste molecole.
R2 NH2 R1 CN R2 NH2 R1 COOH La reazione è generalmente condotta in soluzione acquosa (sia acida che basica) ma nel caso in cui la
molecola contenga altri gruppi suscettibili di idrolisi, si deve optare per una scelta più opportuna. E'' possibile
inoltre modulare le condizioni di reazione in modo fermare l''idrolisi del gruppo nitrile ad ammide. La
biocatalisi offre interessanti soluzioni relative all''idrolisi dei nitrile: l''enzima nitrilasi 207 (EC: 3.5.5.1), idrolizza il nitrile ad acido; la nitrile idratasi 208, enzima cobalto dipendente, (EC: 4.2.1.84) ad ammide. Entrambi gli enzimi sono noti in letteratura per le loro applicazioni su molecole contenenti il gruppo CN tra
cui appunto gli α-amminonitrili.

e) Reazioni con agenti riducenti
La riduzione di un α-amminonitrile con idrogeno su nichel Raney, platino o palladio, o con litio alluminio
idruro in un solvente etereo anidro dà origine ad una 1,2 diammina:

CN R1 R2 H2 / Ni Raney NH2 R1 R2 NH2 NH2 (LiAlH4) solvente etereo 207 Singh, R., Sharma, R., Tewari, N., Geetanjali and Rawat, Diwan S. (2006), Nitrilase and Its Application as a ''Green'' Catalyst. Chemistry &
Biodiversity,
3: 1279''1287. 208 Y. Shen, F. Du, W. Gao, A. Wang and C. Chen, African Journal of Microbiology Research Vol. 2012, 6(32), pp. 6114-6121. Un'eccezione allo schema generale delle reazioni degli α-amminonitrili con gli agenti riducenti è
rappresentata dall'idrogenazione su nichel Raney dei composti sotto riportati in presenza di semicarbazide
che dà α-amminoaldeidi: H2N N H O NH2 H2 / Ni H O NR2 R2N NR2 R2N CN R= C2H4OC2H4, -(CH2)5- f) Reazioni con reagenti organometallici
La reazione degli α-amminonitrili con composti organometallici quali i reattivi di Grignard e gli organolitio
porta alla formazione di α-amminochetoni tramite un meccanismo di addizione-eliminazione. Il prodotto più
comune è però un'ammina ottenuta per sostituzione nucleofila del gruppo ciano da parte del carbanione. Il
rapporto tra l'α-amminochetone e l'ammina aumenta, ad esempio, se l' α-amminonitrile è molto sostituito o
se presenta sostituenti ingombranti legati all'azoto amminico. NH2 CN R1 R2 1.R5MgX (RLi),THF R4 - + Li,THF R2 H2N R1 R3 - + MgX,THF 2. H2O R1 H2N R5 R2 O R3 O R2 H2N R1 R4 O g) Sostituzione nucleofila del gruppo ciano
Gli α-amminonitrili possono subire reazioni di sostituzione nucleofila del gruppo ciano. Il gruppo infatti è un
buon gruppo uscente, se considerato il pKa del suo acido coniugato NH2 CN R1 R2 Nu NH2 R1 R2 Nu
h) Reazioni di eliminazione
Gli α-amminonitrili possono dare reazioni di eliminazione ed un esempio è la β-eliminazione di HCN che dà
enammine: R1 N CN R' R" R2 KNH2 NH3 (l) R1 N R' R" R2 + + NH3 KCN
f) Mobilizzazione dello ione cianuro
La mobilizzazione dello ione cianuro negli α-amminonitrili è promosso dalla donazione del doppietto
elettronico dell'azoto amminico e dà origine ad uno ione immonio, l'intermedio dal quale è possibile
ottenere alcuni tra i diversi prodotti citati in precedenza oltre che i composti carbonilici di origine nei metodi
retrosintetici: N CN R1 R2 - CN N R1 R2 R3 R4 R3 R4 H2O H- - H+ R5M O R1 R2 N R1 R3 R4 R2 ' N R1 R2 R3 R4 R5 N R1 R2 R3 R4 H f) Acidità degli α-amminonitrili
Il protone in α ad un nitrile possiede un certo carattere acido; infatti se gli α-amminonitrili con almeno un
idrogeno in α sono trattati con basi in grado di strappare il protone si generano i corrispondenti anioni che
sono largamente impiegati nella sintesi come equivalenti sintetici di acil anioni ed α-amminocarbanioni. Una possibile applicazione in tale senso risale ad uno studio compiuto sull'α-(dimetilammino)fenilacetonitrile.
L''-amminonitrile di partenza è α-alchilata previo trattamento con sodio ammide in ammoniaca seguito da
addizione di bromuro di benzile. L''intermedio così ottenuto (A) subisce una eliminazione di HCN base-
indotta con formazione dell'enammina (B) che può poi essere ridotta ad ammina (C) o idrolizzata a chetone
in ambiente acido (D). N H CN CH3 H3C Ph 1. KNH2
NH3 (l) 2. BnBr N CN CH3 H3C Ph Ph 1. KNH2
NH3 (l) or ' N Ph Ph H3C CH3 (miscela degli isomeri
geometrici E e Z) H3O + 1. Na,NH3 (l) 2. NH4Cl Ph O Ph Ph NMe2 Ph (A) (B) (C) (D) La capacità di donare elettroni del gruppo amminico-N(CH3)2 favorisce l'allontanamento dello ione cianuro
per riscaldamento, motivo per il quale l'enammina può essere anche ottenuta per distillazione dell'α-
amminonitrile A.










3.2 La sintesi di Strecker degli α-amminonitrili
La sintesi di Strecker degli α-amminonitrili è considerata una delle reazioni più importanti e di grande
interesse in chimica organica e la sua scoperta risale al 1850 209. La sintesi prende il nome da Adolph Strecker, un chimico tedesco vissuto nel diciannovesimo secolo i cui studi furono rivolti ad una varietà di tematiche
riguardanti la chimica inorganica ed organica.
H2O NH4Cl / KCN R R' O R ' R' H2N CN La sintesi degli α-amminonitrili descritta da Strecker nella letteratura del tempo prevedeva la reazione tra
un'aldeide, l'ammoniaca e l'acido cianidrico in ambiente acquoso.
Nel primo passaggio del meccanismo l'aldeide, attivata dal protone dell'acido presente in quantità
stechiometrica, subisce l'attacco nucleofilo da parte dell'ammoniaca con formazione della carbinolammina
N-protonata. L'eliminazione di una molecola di acqua dalla carbinolammina O-protonata genera lo ione
immonio che perde un protone formando la corrispondente immina:
R O H H+ R O H H R O H H NH3 R O H H NH3 - H+ / + H+ R O H H NH2 H - H2O NH2 H R - H + N H R H Nel secondo passaggio l'immina è attivata dalla protonazione e lo ione cianuro agisce da nucleofilo nei
confronti del carbonio imminico, generando l' α-amminonitrile: H+ N H R H N H R H H N H R H H -CN N ' H R H H N
3.2.1 Modificazioni alla sintesi di Strecker
La reazione di Strecker rappresenta senza alcun dubbio il metodo più semplice ed economico per la
preparazione degli α-amminonitrili sia in laboratorio che su larga scala, sicuramente grazie alla disponibilità
commerciale ed ai costi generalmente ridotti dei reagenti utilizzati. Il protocollo di Strecker è stato di
conseguenza estensivamente studiato e sono state introdotte diverse variazioni rispetto alla procedura
originale. La ricerca si è rivolta in particolare alla ottimizzazione dei catalizzatori, del solvente e soprattutto
alla scoperta di fonti di cianuro alternative all''HCN e ai suoi sali. Molto importante risulta anche l''approccio
diastereoselettivo ed enantioselettivo con l''ottenimento di α-amminonitrili chirali. Vediamo ora nei dettagli
quali sono le modifiche più significative che sono state apportate recentemente al protocollo di Strecker.

Catalizzatori 209 Strecker, A. "Ueber die künstliche Bildung der Milchsäure und einen neuen, dem Glycocoll homologen Körper". Annalen der Chemie und
Pharmazie,
1850, 75(1), 27-45 Gli α-amminonitrili sono di solito preparati in presenza di catalizzatori che agiscono da acidi di Brønsted,
acidi o basi di Lewis sebbene diverse procedure di sintesi di questi intermedi sintetici non ne prevedano l'uso
come nel protocollo originale.
I catalizzatori impiegati sono di natura diversa: possono essere ad esempio metalli o non metalli, molecole
inorganiche o organiche, omogenei o eterogenei. Alcuni esempi sono NiCl2, RuCl3, RhI3, InCl3, BiCl3, iodio,
Cu(OTf)2, Et3N, guanidina idrocloruro.

Solventi
Il protocollo di reazione originale prevede di condurre la reazione in soluzione acquosa. L'impiego dell'acqua
comporta numerosi vantaggi: è un solvente economico, facilmente reperibile, non è tossico e non crea
problemi legati al suo smaltimento.
La sintesi di Strecker può essere condotta in presenza di diversi solventi o loro miscele. I più frequenti sono
l'acqua, il metanolo, l'etanolo, il toluene, la N,N-dimetilformammide, il diclorometano, l'acetonitrile ed il
tetraidrofurano. La ricerca di processi più ecosostenibili ha portato all'introduzione dei liquidi ionici come
valida alternativa all'uso dei solventi organici convenzionali; 210 è recente una reazione svolta [bmim]PF6 e [bmim]BF4. La sintesi one-pot a partire da un'aldeide, un'ammina e TMSCN in presenza di un liquido ionico
non richiede l'aggiunta di acidi di Lewis perchè è il mezzo stesso a fungere da catalizzatore promuovendo la
formazione dell'immina. La maggiore ecosostenibilità del processo deriva dalla minore volatilità dei solventi
ionici rispetto ai comuni solventi organici e dalla possibilità di riciclarli facilmente e quindi riutilizzarli più
volte senza perdita di attività catalitica. Alcune metodologie di sintesi degli α-amminonitrili operano
addirittura in assenza di solventi con TMSCN come fonte di cianuro. 211
Fonti di cianuro
La reazione di Strecker originale prevede l'uso dell'acido cianidrico come fonte di cianuro in ambiente
acquoso. Il suo ruolo è anche quello di catalizzatore l''addizione nucleofila al carbonile agendo da acido di
Lewis favorendo la formazione dell'immina. L'estrema tossicità e volatilità di HCN richiedono l'adozione di
particolari misure di sicurezza per evitare i danni alla salute causati da una sua eventuale inalazione o
contatto con la pelle. La tendenza è quindi quella di sostituire l''HCN con altre fonti di cianuro; tra le più
utilizzate KCN, TMSCN 212, Bu3SnCN213, Et2AlCN214, K4[Fe(CN)6]215, (Et2O)P(O)CN216, MeCOCN217 e l'acetone cianidrina 218. I cianuri di sodio o potassio in ambiente acquoso sono fonti di cianuro alternative all''HCN. Sono solidi e quindi più facili da maneggiare;, sebbene sia comunque necessario adottare misure di sicurezza nella
loro manipolazione. Questi sali alcalini a contatto con l'acqua liberano infatti HCN, il promotore della
reazione, ma la loro applicazione nella sintesi di Strecker è limitata. Questo è dovuto sia alla scarsa solubilità
dei cianuri alcalini nei solventi organici che alla generale incompatibilità dei catalizzatori nei confronti
dell'ambiente acquoso.
La tossicità dell'acido cianidrico e dei suoi derivati ha spinto allo studio del trimetilsilil cianuro (TMSCN) come fonte di cianuro nei protocolli di sintesi di Strecker modificata. Il TMSCN è un liquido tossico per inalazione, a
contatto con la pelle o per ingestione; è più facile da maneggiare ed è considerata una migliore fonte di ione
cianuro per l'addizione nucleofila di immine in condizioni blande se confrontato con l'acido cianidrico o con i
cianuri alcalini. Il TMSCN è usato nella sintesi degli α-amminonitrili ma la sostituzione dell'acqua con i
solventi organici come il diclorometano, l'acetonitrile o il toluene (o in assenza di solvente) rende necessaria
la presenza di acidi di Brønsted, acidi o basi di Lewis per promuovere la reazione, a meno che non siano il 210 Yadav, J. S.; Reddy, B. V.; Eshwaraiah, B.; Srinivas, M.; Vishnumurthy, P., New J. Chem., 2003, 27, 462-465
211 Hajipour, A. R.; Ghayeb, Y.; Sheikhan, N., J.Iran. Chem. Soc, 2010, 7, 447-454; Khan, N. H. et al. Tetrahedron Lett., 2008, 49, 1640-644; Baeza, A.;
Nájera, C.; Sansano, J. M. Synthesis, 2007, 8, 1230-1234; Mojtahedi, M. M., Can. J. Chem, 2006, 84, 429-432. 212 a) B. A. Bhanu Prasad, A. Bisai, V. K. Singh, Tetrahedron Lett. 2004, 45, 9565''9567; b) K. Shen, X. H. Liu, Y. F. Cai, L. L. Lin, X. M.
Feng, Chem. Eur. J. 2009, 15, 6008''6014; c) S. Ramesh, K. Sivakuma, C. Panja, P. N. Arunachalam, A. Lalitha, Synth. Commun. 2010, 40, 3544''3551.
213 a) P. Vachal, E. N. Jacobsen, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10012''10014; b) Z. F. Xie, G. L. Li, G. Zhao, J. D. Wang, Synthesis 2009, 2035'' 2039. 214 S. Nakamura, N. Sato, M. Sugimoto, T. Toru, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 1513''1516.
215 Z. Li, Y. Ma, J. Xu, J. Shi, H. Cai, Tetrahedron Lett. 2010, 51, 3922''3926.
216 S. Harusawa, Y. Hamada, T. Shioiri, Tetrahedron Lett. 1979, 20, 4663''4666.
217 F. Cruz-Acosta, A. Santos-Exposito, P. Armas, F. Garcia-Tellado, Chem. Commun. 2009, 6839''6841. 218 S. Sipos, I. Jablonkai, Tetrahedron Lett. 2009, 50, 1844''1846. solvente stesso o l'ammina a fungere da catalizzatori. 219 Il costo elevato di TMSCN (39 '/5 g) non preclude il suo utilizzo nella sintesi degli α-amminonitrili ed esso rimane attualmente la fonte di cianuro alternativa più
utilizzata in letteratura nonostante la ricerca sia orientata all'introduzione di composti più economici. Lo
svantaggio dal punto di vista economico può però limitare l'applicazione di questa fonte di cianuro nell'uso
della reazione di Strecker su larga scala per la sintesi degli amminoacidi chirali, in favore di fonti più
economiche.
Il tributilstagno cianuro (Bu3SnCN) è un solido ed è quindi più facile da maneggiare in laboratorio rispetto all'acido cianidrico. Il suo utilizzo richiede comunque l'adozione di misure di sicurezza dato che è tossico per
inalazione, per contatto con la pelle e per ingestione oltre all'essere irritante per gli occhi, la pelle e le vie
respiratorie. Il Bu3SnCN è considerato più efficace nelle reazioni di addizione nucleofila in condizioni blee
rispetto all'acido cianidrico o ai suoi sali alcalini. Il composto è un reagente stabile in acqua, al contrario di
TMSCN che subisce facilmente l'idrolisi per formare HCN anche in presenza di una piccola quantità di acqua.

3.2.2 L''acetone cianidrina come fonte di cianuro
L'acetone cianidrina (2-idrossiisobutirronitrile, C4H7NO) è un reagente liquido, solubile in acqua e facilmente
maneggiabile; è considerata una delle fonti di cianuro più stabili ed economiche (31.35 $/100g), anche se
tuttavia pericolosa in quanto comunque potenziale fonte di HCN; in acqua il rilascio di HCN avviene molto
lentamente e non in maniera quantitativa, raggiungendo uno stato di equilibrio dopo 18 ore. L'acetone
cianidrina viene ottenuta per reazione tra l'acetone e un cianuro alcalino, ad esempio KCN, in presenza di un
acido: H3C CH3 O H+ H3C CH3 OH H3C CH3 OH C N H3C CH3 OH CN
E'' una molecola molto utilizzata in ambito industriale 220 in quanto è precursore del metilmetacrilato, il monomero del polimetilmetacrilato (PMMA). E'' un reagente comune per la formilazione degli areni e
un''altra caratteristica è quella di generare LiCN particolarmente anidro per reazione con LiH. L'acetone
cianidrina è utilizzata in laboratorio soprattutto nelle reazioni di addizione nucleofila di a pH basico, in
quanto rilascia HCN per deidrocianazione. H3C CN O CH3 H OH H3C O CH3 + H2O CN + Il vantaggio è sicuramente la formazione di acetone facilmente eliminabile dalla miscela di reazione.
In laboratorio la reattività dell''acetone cianidrina come fonte di cianuro viene sfruttata per la sintesi di altre
cianidrine, cosa che avviene peraltro anche in natura. Linamarina 219 Martínez, R.; Ramón, D. J.; Yus, M., Tetrahedron Lett., 2005, 46, 8471-8474.
220 a) R. J. H. Gregory,Chem. Rev. 1999, 99, 3649''3682; b) T. S. A. Heugebaert, B. I. Roman, A. De Blieck, C. V. Stevens, Tetrahedron Lett.
2010, 51, 4189''4191; c) Heugebaert, T. S. A. et al. "A safe production method for acetone cyanohydrin". Tetrahedron Lett., 2010, 51, 4189-4191
In natura l''acetone cianidrina è presente come aglicone su glicosidi cianogenici quali ad esempio la
linamarina (presente nella cassava, nei fagioli di Lima e nel lino) con lo scopo di agire da meccanismo di
difesa contro specie microbiche ed erbivori tramite il rilascio di HCN. Sono noti molti altri agliconi diversi qualil il mandelonitrile (presente sull''amigdalina), l''idrossi mandelonitrile e altre
cianidrine alifatiche. In tutti questi glicosidi
cianogenici il meccanismo di rilascio di HCN è
mediato da liasi dette Idrossi nitrilasi (HNL, 4.2.1).
In figura è riportato il meccanismo per la idrossi
nitrilasi da Hevea Brasiliensis (HbHNL) 221 nella formazione di HCN da acetoncianidrina . L''utilizzo delle HNL in chimica organica ha dato facile accesso alla sintesi di cianidrine chirali 222 col vantaggio di evitare l''utilizzo di HCN, sostituito con le cianidrine che compongono i glicosidi naturali, tra cui appunto l''acetone
cianidrina.
Nel 2002 è stato ipotizzato che le HNL potessere riconoscere le immine come substrati e rilasciare HCN in
modo da ottenere α-ammino nitrili chirali 223; nell''articolo immine enantiomericamente pure ottenute dalla condensazione di aldeidi e (R)-α meilaril ammine, venivano fatte reagire a pH 7-8 con acetone cianoidrina e
un estratto di mandorla contenente R-HNL, con l''ottenimento di rapporti diastereomerici in media 75/25.
Tuttavia, se la stessa reazione viene effettuata nelle stesse condizioni ma senza l''enzima, si ottengono gli
stessi rapporti diastereomerici a causa dell''induzione chirale derivante dalla (R)-ammina. L''acetone
cianidrina infatti a pH basici rilascia l''HCN per deidrocianazione a prescindere dalla presenza dell''enzima o
meno; l''enzima quindi non può catalizzare la reazione, essendo la reazione stessa spontanea.
3.2.3 L''acetone cianidrina come fonte di cianuro per la reazione di Strecker
L''utilizzo dell''acetone cianidrina come fonte di cianuro nell''ambito della reazione di Strecker è rintracciabile
solamente in alcuni sporadici artcoli. 221 G. Gartler, C. Kratky, K. Gruber, Journal og Biotech., 129, 2007, 87-97. 222 J. Andexer, J. Langermann, A. Mell, M. Bocola, U. Kragl, T. Eggert, M. Pohl, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8679 ''8681. 223 T.Lee and Y. Ahn, Bull. Korean Chem. Soc., 2002, 23, 10 Una recente applicazione riguarda la cianazione di alano aldimmine generate in situ con acetone
cianidrina 224. Paraskar and Sudalai hanno riportato l''utilizzo di acetone cianidrina per una sintesi one-pot in solventi
organici utilizzando Et3N come catalizzatore basico 225. Ricci ha riportato un interessante articolo in cui l''acetone cianidrina reagisce con N-Boc α-ammidosulfoni sintetizzando α-amminonitrili enantiomericamente
arricchiti in presenza un catalizzatore di trasferimento di fase chirale. 226 Verma, Jain e Sain riportano nel 2012 una sintesi di α-amminonitrili a partire da ammine terziarie con un
processo di cianazione ossidativa tramite l''utilizzo di RuCl3 catalitico e acqua ossigenata in metanolo. 227
3.2.4 Sintesi one-pot non catalizzata di Strecker con acetone cianidrina 228 Osservando come in letteratura fosse relativamente scarso l''impiego dell''acetone cianidrina nella reazione di
Strecker, abbiamo deciso di studiae un altro e nuovo protocollo di sintesi di α-amminonitrili utilizzando
l''acqua come solvente. Inoltre abbiamo In primo luogo abbiamo deciso di effettuare uno screening
esplorativo su tre aldeidi modello e benzilammina come ammina primaria, per poi evolvere all''utilizzo di
altre specie carboniliche e amminiche.
In particolare il protocollo prevede la preformazione della specie imminica tramite il mescolamento
dell''aldeide e della benzilammina e l''inserimento solo successivo dell''acetone cianidrina e dell''acqua. 224 S. Sipos, I. Jablonkai, Tetrahedron Lett. 2009, 50, 1844''1846.
225 A. S. Paraskar, A. Sudalai, Tetrahedron Lett. 2006, 47, 5759'' 5762.
226 R. P. Herrera, V Sgarzani, L. Bernardi, F. Fini, D. Pettersen, A. Ricci, Chem. Eur. J., 2009, 15, 11642 '' 11659.
227 S. Verma, S. Jain, S. Sain, Catalysis Letters, 2011, 141, 6, 882. 228 P. Galletti, M. Pori, D. Giacomini, Eur. J. Org. Chem. 2011, 3896''3903 R 2 R 3 N
H R 2 R 3 N HO CN R R 1 O + H2O, rt aldehydes, ketones R R 1 CN 1 - 37
Prima di tutto abbiamo studiato il comportamento dell''acetone cianidrina; in acqua la molecola raggiunge
molto lentamente l''equilibrio con l''acido cianidrico 229 mentre, in presenza di un equivalente di ammina o immina, il processo è istantantaneo 230. Con l''obiettivo di riprodurre le esatte condizioni del nostro protocollo di reazione, per cui l''acetone cianidrina si trova in acqua in presenza di un equivalente di immina dell''aldeide
preformata, si è deciso di monitorare la reazione di deidrocianazione a dare acetone in D2O via 1H-NMR, introducendo quantità catalitiche di benzilammina in un caso e successivamente della sua immina con la
benzaldeide.
Effetto dei catalizzatori basici sulla decomposizone dell''acetone cianidrina in D2O. E'' rappresentato il rapporto tra l''integrale del segnale ''.
dell''acetone Ia su quello dell''acetone cianidrina Iac in funzione del tempo.
Nel primo esperimento in un tubo NMR si aggiunge acetone cianidrina (10 µL), D2O (0.7 mL) e 1H NMR e si registra velocemente uno spettro 1H ogni 5 minuti per 35 minuti (riga blu). Lo stesso esperimento viene poi
condotto inserendo 5 mol% di benzilammina (riga verde) e l''immina N-benzilidene-1-feniletanammina (riga
rossa). I tre esperimenti vengono rappresentati come il rapporto (Ia/Iac ) tra l''integrale digitale del segnale dell''acetone (Ia a 2.11 ppm) rispetto a quello dell''acetone cianidrina (Iac a 1.51 ppm) in funzione del tempo. Il
grafico mostra chiaramente un raggiungimento più rapido delle condizioni di equilibrio quando vi è
all''interno una base. In particolare quindi la benzilammina e la sua immina già solo al 5% sono in grado di
catalizzare la decomposizione dell''acetone cianidrina ad acetone e acido cianidrico/ione cianuro
dimostrando quindi come queste siano condizioni adatte all''utilizzo di acetonecianidrina in acqua nella
reazione di Strecker
A questo punto abbiamo condotto uno studio teorico di metrica green; abbiamo studiato l''atom economy
(AE) 231e l''environmental impact factor (EI) della formazione del prodotto 1, nella condizione di resa quantitativa (condizione encessaria affinchè questi parametri abbiano senso) del prodotto. Queste due
grandezze come si sa sono legate dalla seguente relazione: 229 C. H. Li, T. D. Stewart, J. Am. Chem. Soc. 1937, 59, 2596''2599
230 T. D. Stewart, B. J. Fontana, J. Am. Chem. Soc. 1940, 62, 3281''3285. 231 Trost. B. M., Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 1995, 34 (3), 259''281 In particolare si definiscono reazioni a basso impatto ambiental quelle per cui AE > 0.67
contemporaneamente ad un valore di EI < 0.67. Abbiamo inserito nel grafico lo studio della reazione
utilizzando acetone cianidrina, paragonandolo all''utilizzo di altre fonti di cianuro.
Come si osserva, l''acetone cianidrina oltre che ad essere il migliore (ad eccezione dell''acido cianidrico) è
anche classificabile come reagente che porta la reazione ad avere complessivamente un basso impatto
ambientale.
La decomposizione dell''acetone cianidrina in una procedura one-pot può andare incontro a tre destini
differenti: i) può reagire con l''immina intermedia A dando l''amminonitrile di Strecker desiderato; ii) può
reagire con la chetimmina derivante dall''acetone e dall''ammina presente dando l''amminonitrile dell''acetone
B; iii) può reagire direttamente con l''aldeide di partenza fornendo la corrispondente cianidrina C
(quest''ultima reazione può essere visto come un processo competitivo di transcianazione tra l''acetone
cianidrina e l''aldeide). Reazioni possibili nella procedura one pot di Strecket con l''acetone cianidrina in acqua

Dopo aver osservato il comportamento dell''acetone cianidrina utilizzando il nostro protocollo, e avendo
previsto i prodotti possibili, abbiamo iniziato il nostro studio, senza l''utilizzo di alcun catalizzatore,
utilizzando benzilammina su tre aldeidi differenti: benzaldeide, butanale e 2-fenil propanale.












Tabella 1 HO CN R H O BnNH2 + solvent, rt R CN NHBn 1- 3 Ent. R solvent Time (h) Product (Y %) By-products (%) 1 Ph CH2Cl2 20 1 (76) A (24) 2 Bu CH2Cl2 20 2 (76) B (20) 3 CH(CH3)Ph CH2Cl2 20 3 (76) [a] B (10) 4 Ph tBuOMe 20 1 (0) A (99) 5 Bu tBuOMe 20 2 (33) B (33), C (33) 6 CH(CH3)Ph tBuOMe 20 3 (20) n.d. 7 Ph CH3CN 20 1 (36) A (64) 8 Bu CH3CN 20 2 (67) B (33) 9 CH(CH3)Ph CH3CN 20 3 (68) [a] B (11), C (12) 10 Ph Neat 0.5 1 (54) A (46) 11 Bu Neat 0.5 2 (30) n.d 12 CH(CH3)Ph Neat 0.5 3 (99) - 13 Ph tBuOMe /H2O 2 1 (67) A(12),B(8),C(12) 14 Bu tBuOMe /H2O 2 2 (90) B (5) 15 CH(CH3)Ph tBuOMe /H2O 2 3 (87) B (4), C (9) 16 Ph CH3CN /H2O 0.5 1 (99) - 17 Bu CH3CN /H2O 0.5 2 (93) B (7) 18 CH(CH3)Ph CH3CN /H2O 0.5 3 (99) - 19 Ph H2O 2 1 (96) - 20 Bu H2O 0.5 2 (90) B (10) 21 CH(CH3)Ph H2O 20 3 (90) [a] - 22 Ph H2O [b] 2 1 (99) - 23 Bu H2O [b] 20 2 (99) - 24 CH(CH3)Ph H2O [b] 20 3 (99) [c] - Condizioni: aldeidede (1 mmol), benilammina (1 mmol), acetone cianidrina (1.5 mmol), solvente (4 mL), rt. a tracce di acetofenone derivanti dalla decomposizione dell''aldeide
b 1 mmole di acetone cianidrina.
c eccesso diastereomerico 65/35 determinato da HPLC chirale delle relative N-trifluoroacetammidi (IC, hexane / iPrOH 85/15).

La reazione è stata effettuata in diversi solventi: miscele binarie acqua/solvente organico, acqua e senza
solvente. Le reazioni sono state effettuate in vial chiusi per evitare la fuoriuscita di prodotti volatili, messi in
agitazione su un oscillatore orbitale. Le reazioni effettuate direttamente nei solventi organici e senza
solvente sono state direttamente concentrate e analizzate; quelle in acqua sono state prima estratte in
solvent organico. In Tabella 1 per le entry 1-20 sono stati usati 1.5 equivalenti di acetone cianidrina rispetto
all''aldeide, mentre per le entry 21-24, un solo equivalente. Le reazioni sono state controllate tramite analisi
HPLC e NMR e la loro durata riportata è relativa al dato ottenuto che mostra la migliore conversione
dell''aldeide di partenza.
Nei solventi organici CH2Cl2, tBuOMe e CH3CN le rese negli amminonitrili 1-3 sono state scarse e/o modeste
(Tabella 1, entries 1-9). Con benzaldeide l''immina intermedia A (see figure 2) è stata sempre recuperata in
quantità significativa e in particolare in tBuOMe era l''unico prodotto (Tabella 1, entry 4). Le prove con
butanale e 2-fenil propanale hanno dato anche i prodotti B e C (Tabella 1, entries 2, 3, 5, 8, e 9). Senza
solvente la reazione è risultata in generale molto più veloce ma solo la 2-fenil propanale ha portato all'' α-
amminonitrile 3 in modo quantitativo. La benzaldeide ha portato ad 1 con una resa del 53% e un 46% di
immina non reagita; la butanale ha portato a 2 con una resa del 30% assieme a numerosi sottoprodotti non
identificati, probabilmente associati a processi di polimerizzazine dell''aldeide. (Tabella 1, entries 10-12). I
migliori risultati sono stati ottenuti in solventi omogenei o miscele bifasiche solvente organico/acqua. La
miscela tBuOMe/H2O 1:1 ha dato buoni risultati con un numero molto basso di sottoprodotti ad eccezione
della benzaldeide (Tabella 1, entries 13-15). I sottoprodotti A, B e C sono ulteriormente diminuiti usando
miscele omogenee CH3CN/H2O 1:1 e la reazione è risultata anche più veloce (0.5 h per una conversione
completa) (Tabella 1, entries 16-18). Infine abbiamo testato la reazione in sola acqua e nonostante la
formazione di un sistema eterogeneo, abbiamo ottenuto α-amminonitrili in alte rese. La benzaldeide e la 2-
fenil propanale hanno dato buoni risultati mentre solo per la butanale è stata osservata la presenza residua HO CN R H O + H2O, rt 4 - 26 R 1 R 2 N
H amine R 1 R 2 N R CN 1 eq dell''N-benzilammino nitrile dell''acetone, il sottoprodotto B (Tabella 1 entries 19-21). Abbassando la quantità
di acetone cianidrina utilizzata ad 1 solo equivalente, tutte le tre aldeidi in acqua hanno portato alla
formazione dei corrispondenti α-amminonitrili 1-3 in alte rese con la soppressione del sottoprodotto B.
(Tabella 1, entries 22-24).
Da questi risultati preliminari molto positivi utilizzando l''acetone cianidrina abbiamo standardizzato e definito
il protocollo in acqua con i seguenti rapporti molari tra le specie utilizzate: composto carbonilico/ammina/
acetone cianidrina in rapporto molare 1/1/1. E'' quindi stato esteso il protocollo ad altre aldeidi, ammine
(Tabella 2) e chetoni (Tabella 3).


Tabella 2 Ent. R amine product Y% Ent. R amine product Y% 1 Ph PhNH2 Ph N
H CN Ph 4 58 14 4-NO2Ph BnNH2 15 - 2 Ph 1,2 benzenediamine H N H N Ph CN Ph NC 5 33 15 4-NO2Ph BnNH2 NHBn CN O2N 15 5 3 Ph H2NCH2CH2NH2 N H H N CN Ph Ph CN 6 99 16 2-pyridyl BnNH2 N NHBn CN 16 98 4 Ph Morpholine O N CN Ph 7 80 17 Bu H2NCH2CH2NH2 N H H N CN CN 17 65 5 Ph piperidine N CN Ph 8 99 18 Bu AllylNH2 N
H CN 18 99 6 Ph piperazine N N CN Ph CN Ph 9 70 19 Bu PhNH2 N
H Ph CN 19 - 7 2-OHPh BnNH2 OH NHBn CN 10 - 20 Bu 1,2 benzenediamine H
N H
N CN CN 20 - 8 2-OHPh BnNH2 10 65 [a] 21 Bu Morpholine O N CN 21 30 9 2- OCH3Ph BnNH2 OMe NHBn CN 11 86 22 Bu Piperidine N CN 22 99 10 4-OHPh BnNH2 NHBn CN HO 12 trace s 23 Bu Piperazine N N CN CN 23 50 11 4-OHPh BnNH2 12 75 [a] 24 iPr BnNH2 NHBn CN 24 92 12 4- OCH3Ph BnNH2 NHBn CN MeO 13 68 25 tBu BnNH2 NHBn CN 25 99 13 4-ClPh BnNH2 NHBn CN Cl 14 83 26 Bu 4-piperidinone N O CN 26 30 Condizioni: aldeide (1 mmol), ammina (1 mmol) o diammina (0.5 mmol), acetone cianidrina (1 mmol), acqua (4 mL), 20h, rt.
a Senza solvente, 2 equivalenti di acetone cianidrina. La benzilammina e l''allilammina hanno dato risultati eccellenti sia con la benzaldeide che con le aldeidi
alifatiche (Tabella 2 entries 22 e 23, Tabella 2 entries 18, 24, e 25), tra cui la pivalaldeide (entry 25, molto
importante perché l''idrolisi del sui nitrile porta alla tert-leucina). La p-Nitrobenzaldeide, spesso usata come
aldeide modello nelle reazioni di addizione nucleofila, ha portato a rese molto basse; ma in generale le altre
aldeidi aromatiche con gruppi elettrondonatori hanno portato a risultati migliori (Tabella 2 entries 14, 15 vs
entries 9, 11, e 12). L''aldeide salicilica e la 4-OH-benzaldeide hanno dato interessanti risultati, anche se il
risultato migliore è stato ottenuto senza acqua e con 2 equivalenti di acetone cianidrina (entries 8 e 10). I
migliori risultati sono stati comunque ottenuti con il gruppo fenolico protetto come etere metilico. (Tabella 2,
entry 9). L''anilina e la 1,2-benzenediammina porta a rese modeste e a nessuna reazione con la butanale
(Tabella 2, entries 1, 2, e 20).
La 1,2-etilendiammina è stata impiegata con successo sia con la benzaldeide che con la butanale fornendo i
di-amminonitrili corrispondenti come miscela diastereomerica 1:1 (Tabella 2, entries 3 e 17). La piperidina,
modello per le ammine secondarie, ha portato a risultati eccellenti (entries 5 e 22), al contrario di morfolina
e piperazina (entries 4, 6, 21,e 23). E'' da notare che nel caso in cui sono state utilizzare le diammine, non
sono mai state trovate tracce del mono α-amminonitrile.
E'' altresì importante osservare che la maggior parte dei reagenti e dei prodotti sino a qui utilizzati non è
solubile in acqua. Ma le conversioni complete degli starting material e le ottime rese fanno capire come il
processo non necessiti in effetti di avere una solubilità completa. Ha invece un ruolo di sicuro importante
l''effetto idrofobico e l''energia coesiva. 232 HO CN R R1 O + H2O, rt 27 - 37 BnNH2 R R1 BnHN CN ketone Tabella 3 Ent. ketone Time, h temperatur e produc t Y% 1 acetophenone 96 rt 27 a 0 2 acetophenone 48 65 27 a 13 3 acetophenone 72 65 27 35 4 acetophenone 20 90 27 35 5 3-pentanone 20 rt 28 a 20 6 3-pentanone 20 rt 28 a 35 7 3-pentanone 20 rt 28 48 8 2-hexanone 20 rt 29 47 9 20 rt 30 95 10 20 rt 31 99 11 20 rt 32 - 12 20 rt 33 99 13 20 rt 34 99 14 20 rt 35 61 232 a) J. B. F. N. Engberts in Organic Reaction in Water (Ed.: U. M.Lindström), Blackwell Publishing, Oxford, UK, 2007, p. 29; b) S. Otto, J.
B. F. N. Engberts, Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 2809'' 2820. O O O O O O OCH3 15 20 rt 36 50 16 20 rt 37 86 Condizioni: chetone (1 mmole), benzilammina (1 mmole), acetone cianidrina (1 mmole), H2O (4 mL). I chetoni arilici e alchilici aciclici danno in generale risultati insoddisfacenti (Tabella 3 entries 1-8), ma quelli
ciclici portano ad eccellenti rese in linea con la migliore reattività dovuta alla I-strain dei chetoni ciclici
(Tabella 3, entries 9, 10 e 12-14). 233 Il cicloesenone non ha reagito con il nostro protocollo e non sono stati ritrovati nemmeno prodotti di addizione 1,2 o 1,4 (Tabella 3, entry 11).
Il piperidin-4-one è un composto bifunzionale molto interessante e in una procedura one-pot si è
comportato come il componente amminico con la butanale e porta all''α-amminonitrile 26, o come il
componente carbonilico con la benzilammina porteo a 36 come si osserva in Tabella 2 entry 26, e Tabella 3
entry 15. N H NC NHBn N O CN N H O HO CN + BnNH2 CHO 26 36
Dal punto di vista ambientale il bisogno di metodologie sintetiche sostenibili diventa via via di grande
importanza dall''industria al mondo accademico per ogni scala di reazione. Senza dubbio tutte le fonti di
cianuro sono potenzialmente nocive e devono essere usate con estrema precauzione dovuta all''alta tossicità
dell''acido cianidrico ma il protocollo sviluppato ha alcuni vantaggi innegabili: l''atom economy, l''assenza di
catalizzatori, l''utilizzo di acqua e la semplicità della procedura in generale.
L''uso in particolare di 1 equivalente di acetone cianidrina per ottenere l''α-amminonitrile in media in alte
rese e la formazione unica di acetone come sottoprodotto porta il nostro protocollo molto competitivo dal
punto di vista dell''atom economy, soprattutto se confrontato con l''utilizzo di TMSCN, che oltretutto è anche
molto costoso. In più le condizioni di reazione in fase eterogenea del nostro protocollo, hanno il vantaggio
aggiuntivo di poter rimuovere per semplice separazione dalla fase acquosa il prodotto finale.
Abbiamo quindi aumentato la scala della reazione a 4 mmoli e abbiamo appunto osservato che non era più
necessario estrarre il prodotto con un solvente organico, poiché il prodotto si era separato da solo dall''acqua
e una volta separato o filtrato è stato seccato a pressione (Figure 2). Abbiamo quindi aumentato la scale
della reazione senza effettuare alcun work-up con solvente organico per i casi della Tabella 1 entry 24,
Tabella 2 entries 2, 17, 20, 21, 23, e Tabella 3 entry 13 , ottenendo sempre le stesse rese.
233 For the internal strain effect, see: E. L. Eliel, S. H. Wilen, Steoreochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994,
p. 769. N
H O N O Bn 3.3 La sintesi di Strecker asimmetrica
La sintesi di Strecker si sta evolvendo sempre di più verso varianti asimmetriche a causa della richiesta di
nuovi amminoacidi chirali enantiopuri, molecole che possono trovare largo impiego in ambito faramaceutico
come in sintesi organica. Negli ultimi 40 anni sono stati fatti numerosi progressi in quest''area e
generalmente l''approccio a nuovi α-amminonitrili chirali avviene due differenti strategie: la prima è
l''addizione nucleofila di cianuro a immine chirali non raceme e la seconda è la cianiazione enantioselettiva di
immine prochirali.

Induzione asimmetrica
La prima metodologia, cioè l''induzione asimmetrica, può essere associata ad una chiralità presente
nell''ammina oppure nel composto carbonilico di partenza: in genere si osserva l''utilizzo di ammine chirali e
solo pochi esempi sono presenti per i composti carbonilici. L''utilizzo di ammine chirali come ausiliari chirali è
quindi diventato molto diffuso e la reazione di Strecker si è evoluta in metodologie molto robuste che
portano all''ottenimento di numerosi α-amminonitrili. Questa strategia ovviamente richiede quantità
equimolari di ausiliare chirale, il quale dopo la reazione può essere rimosso e riutilizzato, oppure mantenuto
all''interno della struttura. Il primo esempio in assoluto di reazione di Strecker asimmetrica è stato effettuato
da Harada nel 1963, 234 ben più di 110 anni dopo la scoperta dello stesso protocollo di Strecker. L''ausiliario chirale utilizzato, l''(S)-α-feniletilammina enantiopura ((S)-PEA), è stato utilizzato al posto dell''ammoniaca
sull''acetaldeide; il risultato della modifica è stato l''ottenimento del corrispondente α-amminonitrile in un
rapporto diastereomerico 3.3/1. Dopo la rimozione dell''ausiliario e l''idrolisi ad acido carbossilico del
diastereoisomero maggioritario, è stata ottenuta l''L alanina con una resa del 17% ed un eccesso
enantiomerico del 90%.

Di conseguenza sono stati preparati altri α-amminonitrili utilizzando la stessa strategia. E'' il caso dell''utilizzo
dell''(R)-PEA su enoli ciclici, con successivo trattamento con NaCN. 235

Interessanti risultati sono stati ottenuti nella sintesi diastereiselettiva a partira da Aril Metil ketenimmine. 236 234 K. Harada, Nature 1963, 200, 1201
235 Fadel, A.; Lahrache, N., J. Org. Chem., 2007, 72, 1780 236 Weinges, K.; Gries, K.; Stemmle, B.; Schrank, W. Chem. Ber., 1977, 110, 2098 Successivamente come induttori chirali sono stati utilizzati amminoli 237 e amminoammidi.238
Un importante esempio utilizza l''R Fenil Glicinolo; in figura è mostrata la rimozione dell''induttore per opera
di Pb(OAC)4, con successiva idrolisi acida.
In 1987, Kunz 239 ha sviluppato una reazione asimmetrica di Strecker utilizzando una galattosilammina (O- pivaloyl-β-D-galactopyranose); come si osserva, si effettua la reazione con TMSCN come fonte di cianuro in
presenza di un acido di Lewis e successivamente si idrolizza l''amminale e si idrolizza il nitrile in un passaggio
solo.

Più recente è l''utilizzo da parte di Mukujama 240 di sulfinimmine chirali generate dalla (S)-para toluen sulfinammide
Nel 1996 è stata utilizzata come induttore chirale la (S)-1-amino-2-methoxymethylindoline (SAMI) da KIM,
ottenendo R idrazino nitrili diastereomericamente puri; questo è stato il primo esempio di addizione di 237 a) Dave, R. H.; Hosangadi, B. D. Tetrahedron 1999, 55, 11295; b) Wang, X.-J.; Zhang, F.; Liu, J.-T. Tetrahedron 2008, 64, 1731; c) Ma, D.; Tian, H.;
Zou, G. J. Org. Chem. 1999, 64, 120; d) Warmuth, R.; Munsch, T. E.; Stalker, R. A.; Li, B.; Beatty, A. Tetrahedron 2001, 57, 6383; e) Tang, G.; Tian,
H.; Ma, D. Tetrahedron 2004, 60, 10547; f) Huguenot, F.; Brigaud, T. J. Org. Chem. 2006, 71, 7075 238 Boesten, W. H. J.; Seerden, J.-P. G.; de Lange, B.; Dielemans, H. J. A.; Elsenberg, H. L. M.; Kaptein, B.; Moody, H. M.; Kellogg, R. M.; Broxterman, Q.
B.
Org. Lett. 2001, 3, 1121.
239 (a) Kunz, H.; Sager, W. Angew. Chem., Int. Ed. 1987, 26, 557; (b) Kunz, H.; Sager, W.; Schanzenbach, D.; Decker, M., Liebigs Ann. Chem. 1991, 649 240 Takahashi, E.; Fujisawa, H.; Yanai, T.; Mukaiyama, T. Chem. Lett., 2005, 34, 604. cianuro a idrazoni chirali. La reazione necessita di temperature molto basse e almeno 2 equivalenti di acido
di Lewis.

Catalisi enantioselettiva
L''altro approccio alla sintesi di α-amminonitrili chirali enantiopuri tramite la razione di Strecker è la catalisi
enantioselettiva. In generale si utilizzano substrati prochirali e quantità substechiometriche di catalizzatore
chirale. La chiave è la scelta del giusto catalizzatore che si adatti natura dell''α-amminonitrile target. La
ricerca nell''ambito della catalisi si sta sviluppando molto velocamente pure essendo relativamente nuova,
con il primo articolo pubblicato solo nel 1996 da Lipton, 241 il quale riporta l''utilizzo di un dipeptide ciclico.

La nostra ricerca si è direzionata però verso l''utilizzo dell''induzione asimmetrica, utilizzando le conoscenze
pregresse del mio gruppo di ricerca verso questa tematica. In passato infatti è stata accuratamente studiata
l''addizione asimmetrica di cianuro su immine sostituite dell''aldeide lattica in presenza di acidi di Lewis. 242

Utilizzando quindi il nostro protollo di Strecker di sintesi racema di α-amminonitrili in acqua con acetone
cianidrina, abbiamo studiato la versione asimmetrica tramite induzione chirale data da ammine primarie e
secondarie otticamente attive. R1 H R2 NH2 CN HO R2 N H R1 O R3 R3 CN + 38-45 46-62 H2O R' = Ph,Pr, i-pr, t-bu

3.3.1 Sintesi asimmetrica one-pot non catalizzata di Strecker con acetone cianidrina
243 Tabella 4 241 Iyer, M. S.; Gigstad, K. M.; Namdev, N. D.; Lipton, M., J. Am.Chem. Soc., 1996, 118, 4910
242 Cainelli, G.; Giacomini, D.; Trer_e, A.; Galletti, P. Tetrahedron:Asymmetry 1995, 6, 1593 243 M. Pori, P. Galletti, R. Soldati, D. Giacomini, Eur. J. Org. Chem, 2013, accepted Ent. Ald., (R 1) Amine Products Y% [a] dr (a/b) Ent. Ald., R 1 Amine Products Y% [a] dr (a/b) 1 Ph 38 Ph (S) N H (S) Ph CH3 CN 46a Ph (S) N H (R) Ph CH3 CN 46b 99 69/31 10 Ph 41 [b] Ph (S) N H (R) Ph CO2Me CN 55a Ph (S) N H (S) Ph CO2Me CN 55b 73 68/32 2 Pr 38 Ph (S) N H (S) Pr CH3 CN 47a Ph (S) N H (R) Pr CH3 CN 47b 99 74/26 11 Pr 41 b Ph (S) N H (R) Pr CO2Me CN 56a Ph (S) N H (S) Pr CO2Me CN 56b 41 77/23 3 iPr 38 Ph (S) N H (S) iPr CH3 CN 48a Ph (S) N H (R) iPr CH3 CN 48b 99 67/33 12 Ph 42 [b] (S) N H (R) Ph CO2Me CN 57a (S) N H (S) Ph CO2Me CN 57b Ph Ph 64 67/33 4 tBu 38 Ph (S) N H (S) tBu CH3 CN 49a Ph (S) N H (R) tBu CH3 CN 49b 99 65/35 13 Pr 42 [b] (S) N H (R) Pr CO2Me CN 58a (S) N H (S) Pr CO2Me CN 58b Ph Ph 25 63/37 5 Ph 39 Ph (S) N H (R) Ph CN 50a Ph (S) N H (S) Ph CN 50b OH OH 85 81/19 14 iPr 43 (S) N H (R) iPr CN 59a (S) N H (S) iPr CN 59b Ph Ph OH OH 80 53/47 6 Pr 39 Ph (S) N H (R) Pr CN 51a Ph (S) N H (S) Pr CN 51b OH OH 99 80/20 15 iPr 44 N H OH Ind iPr CN N H OH Ind iPr CN 60a 60b (S) (S) (R) (S) 62 57/43 7 iPr 39 Ph (S) N H (R) iPr CN 52a Ph (S) N H (S) iPr CN 52b OH OH 97 83/17 16 Ph 45 [b] N H Ph CO2Me CN 61b N H Ph CO2Me CN 61a Ind Ind (S) (S) (S) (R) 31 63/37 8 Ph 40 Ph (S) N H (R) Ph CN 53a Ph (S) N H (S) Ph CN 53b OMe OMe 78 64/36 17 Pr 45 [b] N H Pr CO2Me CN 62b Ind N H Pr CO2Me CN 62a Ind (S) (S) (R) (S) 40 57/43 9 Pr 40 Ph (S) N H (R) Pr CN 54a Ph (S) N H (S) Pr CN 54b OMe OMe 98 71/29 aresa comprendente entrambi gli stereoisomeri bammina usata come cloridrato e trattata in situ con un equivalente di TEA

Le prime prove sono state svolte con le ammine primarie: come aldeidi modello abbiamo scelto la
benzaldeide, la butanale, la isobutirraldeide e la pivalaldeide (Tabella 4); come ammine chirali abbiamo
testato l''induttore chirale di Harada, l''(S)-1-feniletilammina (38), α-amminoli, α-amminoeteri tra cui l''(S)-2-
ammino-2-feniletanolo (39), l''(S)-2-metossi-1-feniletilammina (40), (S)-2-ammino-3-fenilpropan-1-ol (43
), l''(S)-2-ammino-3-(1H-indol-2-il)propan-1-ol (44), e gli esteri metilici della L-fenilglicina (41), of L-
fenilalanina (42), e L-triptofano (45). Abbiamo testato anche gli α-ammino acidi liberi ma senza risultato.
Il protocollo, come in precedenza, consiste nel ''pre-mixing' a temperatura ambiente dell''aldeide e
dell''ammina chirale a formare l''immina, per poi aggiungere un equivalente di acetone cianidrina e acqua e
lasciare la reazione in agitazione su di un oscillatore orbitale. Le reazioni in generale sono avvenute con
facilità e il migliore risultato in termini di resa è stato ottenuto con l''ammina 38 e gli α-amminoli 39, e 43.
Utilizzando gli esteri metilici di -amminoacidi 41, 42, e 45 abbiamo osservato la presenza di sottoprodotti tra cui la cianidrina dell''aldeide; l''α-amminonitrile puro è stato purificato solo tramite flash cromatografia
ottenendo rese più basse. Per quanto riguarda la diastereoselettività, l''ammina 38 ha portato ad una miscela
di stereoisomeri 2:1 (i diastereoisomeri a e b). (Tabella 4, entries 1-4, prodotti 46-49). Gli amminonitrili 46, 244 47 245, 48,246 e 49247 sono composti noti e la configurazione assoluta dei diatereoisomeri maggioritari 46a-49a è stata assegnata essere (S,S) (1,3 ''syn') dagli 1H NMR della letteratura. L''(S)-Fenilglicinolo 39 ha in generale portato ad un aumento dei rapporti diastereomerici con tutte le aldeidi
(Tabella 4, entries 5-7, composti 50-52), fino al valore migliore 83/17 per i composti 52a-b. La configurazione
assoluta dei diastereoisomeri maggioritari 50a e 52a è stata assegnata essere (S,R) per confronto con gli 1H NMR degli stessi prodotti da letteratura. 248 Per i composti 51a-b la configurazione è stata assegnata paragonandoli agli spettri 1H NMR degli amminonitrili 50a-b e 52a-b. In particolare abbiamo osservato un trend simile e costante dei chemical shift del protone sul carbonio in alfa al gruppo CN: il segnale del protone
CHCN nei diastereoisomeri maggioritari 50a e 52a è più schermato rispetto a quello dei diastereoisomeri
minoritari (50b e 52b). Lo stesso trend è stato osservato per 51a e 51b permettendo quindi anche in questo
caso l''attribuzione della configurazione. Nonostante la differenza dei descrittori stereochimici del
diastereoisomero maggioritario (S,S) per gli amminonitrili 46a-49a e (S,R) per 50a-52a, la stereoinduzione
esercitata dall''ammina 39 è stata la medesima dell''ammina di Harada 38, essendo sempre dominante lo
stereoisomero 1,3 ''syn' in tutti i casi.
Il ruolo chiave del gruppo OH nell''L fenil alaninolo nel migliorare il rapporto diastereomerico è stato
dimostrato usando come ammina l''analogo O-metiltere 40. Sono infatti stati ottenuti rapporti
diastereomerici più bassi per gli amminonitrili 53a-b e 54a-b: 64/36 e 71/29 rispettivamente.
L''assegnazione della configurazione (S,R) per 53a e 54a è stata fatta in base allo stesso trend del chemical
shift di CHCN osservato per i composti 50 e 52, come discusso sopra. Per verificare ulteriormente e
definitivamente l''attribuzione della configurazione, il composto 50a è stato direttamente trasformato nel
composto 53a tramite una semplice O-metilazione. Per quanto riguarda l''induzione chirale dei metil esteri,
(Tabella 4, entries 10-13 e 16-17), si è osservato che i rapporti diastereomerici non erano elevati con il valore
migliore di 77/23 per 56a-b ottenuto con il metil estere della L-fenilglicina 41 e la butanale. La
configurazione dei composti 55a-b è stata attribuita essere (S,R) dalla trasformazione di una miscela 2/1 di
55a/55b in una miscela 2/1 di 50a/50b tramite riduzione dell''estere metilico con NaBH4. La configurazione
degli amminonitrili 56a-b, 57a-b, 58a-b, 59a-b, e 60a-b è stata assegnata in funzione del trend all'' 1H NMR per l''intera serie. Gli amminonitrili 61a-b sono noti e la configurazione è stata assegnata da NMR della
letteratura. 249 Da questi screening preliminari si è osservato che le ammine che presentavano maggiore flessibilità sul
carbonio beta, ad esempio le ammine 43 e 44, portavano ad una scarsa diastereoselettività (Tabella 4,
entries 12 e 17). Le aldeidi sostituite in alfa invece sembra possano influenzare leggermente il rapporto
diastereomerico (Tabella 4, entries 2, 7, 9, e 11) con poche eccezioni (entries 2 e 13).

Il nostro protocollo di Strecker, come si è visto in precedenza, si è dimostrato valido anche con l''utilizzo di
ammine secondarie. Abbiamo quindi deciso di estendere lo studio agli esteri della L-prolina 63-65, i derivati
dell''L-prolinoloo, 66-67, gli esteri della L-(4R)-idrossi-prolina 68, l''L-(4R)-idrossi-L-prolinoloo 69 (Tabella 5)
utilizzando come aldeidi modello la benzaldeide e la butanale.
Dal punto di vista delle rese di reazione, il difenilprolinolo 67 con la butanale ha portato all''amminonitrile
78a-b in modo quantitativo, ma in tutti gli altri casi sono stati osservati quantitativi variabili di cianidrine
delle aldeidi e reagenti di partenza; è stato quindi spesso necessario purificare il prodotto con colonna
cromatografica, portando ad un abbassamento della resa. Gli esteri della L-Prolina 63, 64 e 65 come
induttori chirali hanno fornito sempre gli stessi valori di eccesso diastereomerico (valore medio osservato: 244 A. Kazemeini, N. Azizi, M. R. Saidi, Russ. J. Org. Chem. 11412006, 42, 46''49
245 M. C. Daga, M. Taddei, G. Varchi, Tetrahedron Lett. 2001, 42, 5191''5194 246 a) L. Royer, S. K. De, R. A. Gibbs, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 4595''4597; b) T. Inaba, M. Fujita, K. Ogura, J. Org. Chem. 1146 1991, 56, 1274''1279
247 J.-L. Fauchère, C. Petermann, Helv. Chim. Acta 1980, 63, 824''31
248 a) R. H. Dave, B. D. Hosangadi, Tetrahedron 1999, 55, 11295'' 11308; b) D. Leung, E. V. Anslyn, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 1151, 12328''12333; c)
T. K. Chakraborty, K. A. Hussain, G. V. Reddy, Tetrahedron 1995, 51, 9179''9190. 249 J. A. Gonzalez-Vera, M. T. Garcia-Lopez, R. Herranz, J. Org. Chem. 2005, 70, 8971''8976 75/25) indipendentemente dal gruppo estereo (metilico, tbutilico o benzilico) o dall''aldeide utilizzata
(Tabella 5, entries 1-5 10, e 11). Con l''(S)-Prolinolo 66 sono stati ottenuti risultati migliori ottenendo 75 e 76
con rapporti diastereomerici 82/18 con benzaldeide e butanale (entries 6 e 7). L''(S)-α,α-Difenilprolinolo 67
ha dato il miglior risultato portando ad un solo diastereoisomero, generando un solo amminonitrile sia con la
benzaldeide che con la butanale (Tabella 5, entries 8, e 9). Inoltre, l''amminonitrile enantipuro 78a è stato
ottenuto in resa quantitativa senza alcuna purificazione. Per quanto riguarda gli amminonitrili derivanti dalla
prolina, la configurazione assoluta è stata assegnata essere (S,S) per il diastereoisomero maggioritario
tramite raggi X del cristallo singolo e 1H NMR. I prodotti 70-76 e 79-82 hanno mostrato lo stesso trend all''1H NMR per il chemical shift del protone CHCN, essendo il maggior diastereoisomero sempre più deschermato
del minore per tutta la serie. Sul composto 78a è stata fatta la diffrazione a raggi X del cristallo singolo e la
struttura risolta è rappresentata sotto. L''attribuzione della configurazione assoluta al composto 79a è stata
fatta trasformandolo nello iodo derivato 83a tramite reazione di Mitsunobu 250 che ha portato all''ottenimento di un prodotto cristallino adatto per le analisi di diffrazione ai raggi X. I dati di diffrazione a
raggi X per entrambe le strutture ha inequivocabilmente confermato la configurazione S del nuovo
stereocentro.
Strutture ai raggi X di 78a e 83a
La stereochimica e il trend dei segnali all'' 1H NMR sono stati avvalorati da numerose trasformazioni chimiche. Il prodotto 79a è stato trasformato nel 81a tramite riduzione dell''estere con NaBH4; 80a è stato
trasformato in 82a in maniera analoga e così 70a nel composto 75a. Infine il prodotto 70a è stato convertito
nel composto 77a tramite reazione di Grignard con il PhMgBr.
Abbiamo tentato di dare una interpretazione meccanicistica alla reazione one-pot di Strecker proponendo
due differenti meccanismi: il primo tramite la formazione di un''immina (o ione immino) intermedia, il
secondo tramite un amminolo intermedio. 251 La via che passa per immina appare la più plausibile per quei casi in cui la reazione di Strecker viene effettuata in solventi organici e in presenza di agenti disidratanti,
fattori che promuovono la formazione della base di Schiff a causa della eliminazione di acqua. In ogni caso
Tanaka e i suoi collaboratori hanno dimostrato che la formazione di immine è efficiente anche in acqua
miscelando aldeidi aromatiche e ammine, separando poi le immine ottenute dal solvente acquoso come
prodotti cristallini in buone rese. 252 R1 H CN HO R' = Ph,Pr, i-pr, t-bu O + 63-69 H2O N H R5 R4 N R5 R4 CN R1 N R5 R4 CN R1 70-82 Tabella 5 Ent. R 1 Amine Products Y% [a] dr (a/b) Ent. R 1 Amine Products Y% [a] dr (a/b) 250 N. Shangguan, M. Joullie, Tetrahedron Lett. 2009, 50, 6748''6750
251 G. W. Zhang, D. H. Zheng, J. Nie, T. Wang, J. A. Ma, Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 1399''1405; M. Barbero, S. Cadamuro, S. Dughera, G. Ghigo, Org.
Biomol. Chem. 2012, 10, 4058-4068. 252 K. Tanaka, R. Shiraishi, Green Chem. 2000, 2, 272''273 1 Ph 63 b N (S) CO2Me (S) CN Ph 70a N (S) CO2Me (R) CN Ph 70b + 50 75/25 8
Ph 67 N (S) (S) CN Ph 77a N (S) (R) CN Ph 77b + OH OH Ph Ph Ph Ph 50 >99 2 Pr 63 b N (S) CO2Me (S) CN Pr 71a N (S) CO2Me (R) CN Pr 71b + 50 75/25 9 Pr 67 N (S) (S) CN Pr 78a N (S) (R) CN Pr 78b + OH OH Ph Ph Ph Ph 97 >99 3 Ph 64 N (S) CO2tBu (S) CN Ph 72a N (S) CO2tBu (R) CN Ph 72b + 33 75/25 10 Ph 68 [b] N (S) (R) CO2Me (S) CN Ph 79a N (S) (R) CO2Me (R) CN Ph 79b + HO HO 58 66/34 4
Pr 64 N (S) CO2tBu (S) CN Pr 73a N (S) CO2tBu (R) CN Pr 73b + 34 75/25 11 Pr 68 [b] N (S) (R) CO2Me (S) CN Pr 80a N (S) (R) CO2Me (R) CN Pr 80b + HO HO 69 71/29 5 Ph 65 [b] N (S) CO2Bn (S) CN Ph 74a N (S) CO2Bn (R) CN Ph 74b + 53 75/25 12 Ph 69 N (S) (R) (S) CN Ph 81a N (S) (R) (R) CN Ph 81b + OH OH HO HO 45 86/14 6 Ph 66 N (S) (S) CN Ph 75a N (S) (R) CN Ph 75b + OH OH 35 82/18 13 Pr 69 N (S) (R) (S) CN Pr 82a N (S) (R) (R) CN Pr 82b + OH OH HO HO 46 86/14 7 Pr 66 N (S) (S) CN Pr 76a N (S) (R) CN Pr 76b + OH OH 31 82/18 aresa comprendente entrambi gli stereoisomeri
bammina usata come cloridrato e trattata in situ con un equivalente di TEA

Studi computazionali sull''effetto della struttura dell''ammina sulla formazione dell''imminio intermedio con
aldeidi in acqua evidenziano la formazione di amminoli e specie imminio come punti stazionari con un''alta
barriera, specialmente nel caso di ammine cicliche secondarie come il metil estere della prolina e la
pirrolidina. 253 Per quanto riguarda gli L-prolinoli e la presenza del gruppo alcolico primario, è possibile la formazione di 1,3-ossazolidinoni biciclici assieme alla formazione di intermedi immina/imminio e
amminoli. 254 Per ottenere un''evidenza degli intermedi che si formano nel nostro processo non catalizzato in acqua,
abbiamo effettuato analisi NMR con benzaldeide, butanale, L-prolinolo 66 e L-difenilprolinolo 67. In
particolare abbiamo miscelato una quantità equimolare di aldeide e ammina a temperatura ambiente in
tubo NMR e in due solventi, D2O e CDCl3, e abbiamo velocemente analizzato le due soluzioni. Gli spettri
ottenuti, a volte molto complessi, hanno mostrato la presenza di diverse specie in soluzione. Nel caso dell''L
prolinolo 66 miscelato con benzaldeide in CDCl3 e D2O sono state ottenute due nuove specie distinte con
253 G. J. S. Evans, K. White, J. A. Platts, N. C. O. Tomkinson, Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2616''2627 254 M. B. Schmid, K. Zeitler, R. M. Gschwind, J. Am. Chem. Soc. 1166, 2011, 133, 7065''7074 segnali specifici nel range 5.4-5.5 ppm assieme a quantità di reagenti di partenza. Gli stessi spettri ossrvati
con butanale e il prolinolo 66 hanno mostrato la formazione di specie simili a 4.0-4.5 ppm in D2O, assieme a
piccole tracce dell''aldeide idrata e della specie immonio. Dopo addizione di acetone cianidrina, i segnali delle
due specie nei range di chemical shift assegnati sono scomparse per dare luogo ai segnali dei corrispondenti
nitrili.
RCHO + N H OH N OH R OH N OH R OH + N O R N O R N OH R R' R' major minor HO CN R' R' R' R' R' R' H2O N OH R CN N OH R CN + R' R' R' R' major minor (S) (S) (S) (R) R = Ph, Pr R' = H, Ph N O R CN N HO R CN Re face N OH R CN R' R' (S) (S) R' R' R' R' R' R' R' R' +
Il rapido consumo delle specie è in accordo con la nostra osservazione per cui l''acetone cianidrina in acqua si
decompone rapidamente in presenza di ammina o specie imminiche.
Le analisi attente degli spettri 1H e 13C NMR unite al confronto con spettri reali delle 1,3-ossazolidine riportate in letteratura, 255ci hanno portato ad attribuire i chemical shift delle due specie intermedie proprio alla struttura delle 1,3-ossazolidine, che si classificano quindi come due specie intermedie. In ogni caso il
rapporto diastereomerico osservato per le due specie ossazolidiniche intermedie è 7:3 da NMR, valore che
non corrisponde al rapporto tra il diastereoisomero maggioritario e minoritario degli ammino nitrili finali
(42a/ 42b è infatti 82/18, Tabella 5). Questo può voler dire che la situazione è ancora più complessa e che
sussiste un equilibrio tra le specie ossazolidiniche.
Per quanto ruguarda invece gli 1H NMR del difenilprolinolo 67 (a contatto con la benzaldeide e la butanale) in CDCl3, sono stati osservati grandi quantitativi di reagente di partenza ma la presenza di un solo isomero
1,3--ossazolidinico 256 che in questo caso concorda con la formazione finale di un solo α-amminonitrile (Tabella 5 entries 8 e 9).
Ma la presenza di un intermedio biciclico potrebbe essere anche la prova di una elevata reattività della
specie imminio che molto probabilmente ha un tempo di vita breve in soluzione acquosa e ciclizza molto
rapidamente a livello intramolecolare. In ogni caso, nonostante la presenza di numerosi intermedi anche non
identificabili, dopo l''addizione di acetone cianidrina in acqua tutti gli equilibri si spostano in maniera
produttiva verso la sintesi degli α-amminonitrili. Per quanto riguarda la costruzione di un modello per
l''induzione asimmetrica esercitata dagli L-prolinoli, la formazione esclusiva degli (S,S)-amminonitrili potrebbe
derivare dalla addizione sulla faccia Re dell''imminio o da sostituzione bimolecolare diretta dalla parte
opposta delle relative 1,3-ossazolidine. 255 a) M. Dali, H. Boudiaf, A. Boukhari, Res. J. Appl. Sci. 2007, 2, 759''762; b) V. I. Tararov, R. Kadyrov, T. H. Riermeier, A. Börner, Synthesis 2002, 375''
380 256 G. Zuo, Q. Zhang, J. Xu, Heteroat. Chem. 2003, 14, 42''45 Tutti i derivati di natura prolinica non sono mai stati sintetizzati e considerando l''importanza e l''utilità dei
derivati prolinici in chimica organometallica e organocatalisi, la conservazione dello scheletro della L-prolina
e della 4(R)-idrossi-(S)-prolina nella molecola finale permette l''ottenimento di interessanti prodotti
bifunzionali, eventualmente utilizzabili per la sintesi di nuovi leganti chirali. Abbiamo quindi analizzato la
reattività di alcuni ammino nitrili a base prolinica per quanto riguarda la reazione di riduzione e idrolisi per
esplorare la loro trasformazione in nuovi amminoli o amminoacidi chirali. Abbiamo quindi trattato i nitrili
isolati 70a e 71a con LiAlH4 ottenendo gli 1,5-amminoli chirali 84a e 85a rispettivamente per contemporanea
riduzione del gruppo estereo e ciano.
Per quanto riguarda la letteratura, le reazione di idrolisi del nitrile dovrebbe avere un carattere di ''reazione
ordinaria'. Noi abbiamo comunque osservato che l''idrolisi dell''amminonitrile 70a (isomero isolato) avviene
solo in condizioni drastiche in HCl 37% per 24 ore a riflusso portando ad una miscela 75/25 dei due
diastereoisomeri 86a e 86b con una resa totale dell''88%. Per evitare il fenomeno di epimerizzazione
abbiamo provato diverse procedure più ''soft' note in letteratura tra cui HCl al 5% in diossano, 257 H2SO4 in Riduzione di alcuni α-amminonitrili chirali
CH2Cl2 at 0°C or 1M NaHCO3 258 . Nessuna di queste procedure ha portato all''acido dicarbossilico, ma solo a fenomeni di epimerizzazione del reagente di partenza, all''ottenimento di prodotti della reazione di retro-
Strecker e in alcuni casi nessuna reazione. E'' stata provata senza successo anche una procedura di alcolisi
con HCl in metanolo per trasformare il nitrile in estere metilico. 259 D''altra parte è stato ottenuto un buon risultato idrolizzando il nitrile 70a all''ammide 87a con una resa
quantitativa e senza epimerizzazione, utilizzando una quantità stechiometrica di TiCl4 in acido acetico e 4
equivalenti of acqua. 260 E'' interessante notare come la stessa procedura applicata al 4-idrossiprolinolo nitrile 81a ha portato al lattone biciclico 88a per opera di uan ciclizzazione intramolecolare. 257 P. Vongvilai, O. Ramström, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131,14419''14425
258 F. Fringuelli, O. Piermatti, F. Pizzo, J. Chem. Educ. 2004, 81, 874''876
259 G. R. Lee, J. A. Crayston, Polyhedron 1996, 15, 1817 260 T. Mukaiyama, K. Kamio, S. Kobayashi, H. Takei, Chem. Lett., 1973, 357 N CO2Me CN LiAlH4 THF, 0° rt N NH2 OH 71a N Ph CO2Me CN LiAlH4 THF, 0° rt N Ph NH2 OH 39% 70a 84a 85a 36% N CO2Me CN Ph 70a N CO2H CO2H Ph HCl 37% 88% H Cl N CO2H CO2H Ph H Cl 86a 86b dr 75/25 TiCl4, H2O
CH3CO2H N CO2Me CONH2 Ph 99% 87a N Ph CN HO OH N Ph HO O O 81a 88a + 40% H2O, CH3CO2H TiCl4 drolisi di alcuni α-amminonitrili chirali
Il risultato riportato sopra per quanto riguarda il fenomeno di epimerizzazione durante la reazione di idrolisi
e i fenomeni sperimentali di epimerizzazioni spontanee e inaspettate di vecchi campioni di nitrili ci ha
portato a riflettere e ad affrontare il problema della stabilità configurazionale degli alfa-amminonitrili. Per
esempio abbiamo osservato che l''isomero minoritario isolato 70b nel tempo si è convertito spontaneamente
nel maggioritario 70a, ma non il maggioritario 70a; inoltre in una miscela 86/14 del composto 81, il
diastereoisomero minoritario 81b si è convertito completamente nel maggioritario 81a in un mese.
L''epimerizzazione degli α-amminonitrili è già riportata in letteratura. Sakurai, ad esempio, ha osservato
l''epimerizzazione di α-aril amminonitrili stereoisomericamente puri se dissolti DMSO o scaldati. 261 Abbiamo quindi preparato soluzioni di DMSO-d6 degli amminonitrili puri e isolati 70a e 70b e li abbiamo
scaldati a 80 °C per 24 ore. Gli spettri 1H NMR di entrambi i nitrili registrati dopo hanno mostrato tracce di benzaldeide e del metil estere della L-prolina, oltre a prodotti di epimerizzazione con un rapporto
diastereomerico finale di 68/32 (70a/70b) partendo da 70a, e 65/35 (70a/70b) partendo da 70b,
rispettivamente. In un secondo esperimento abbiamo scaldato senza solvente i due amminonitrili 79a e 79b
per 24 ore a 80 °C osservando alla fine identici spettri 1HNMR in CDCl3 mostrando epimerizzazione con lo stesso valore di eccesso diastereomerico: 79a/79b pari a 72/28. Anche in questi casi abbiamo osservato
tracce del reagente di partenza, benzaldeide e del metil estere della trans 4-idrossi-(S)-prolina assieme ad
altri due diastereoisomeri derivati da una parziale racemizzazione (circa il 15%) sul carbonio in α dell''estere.
Nel caso dei derivati della butanale 80a-b, gli stessi esperimenti hanno portato ad una miscela complessa di
prodotti e a spettri non interpretabili.
La presenza di reagenti di partenza e l''osservazione che i rapporti diastereomerici ottenuti negli esperimenti
di isomerizzazione sono consistenti con quelli ottenuti dal protocollo di Strecker, suggeriscono che
l''epimerizzazione abbia luogo tramite un protocollo di retro-Strecker secondo un meccanismo di
cianazione/deidrocianazione (Tabella 5 entries 1 e 10,).
261 R. Sakurai, S. Suzuki, J. Hashimoto, M. Baba, O. Itoh, A. Uchida, T. Hattori, S. Miyano, M. Yamaura, Org. Lett. 2004, 6, 2241''2244 3.4 Parte Sperimentale
Parte sperimentale relativa al paragrafo 3.2.4
Parte strumentale
Commercial reagents were used as received without additional purification. 1H and 13C NMR spectra were recorded with an INOVA 400 or a GEMINI 200 instrument with a 5 mm probe. All chemical shifts are quoted
relative to deuterated solvent signals (δ in ppm and J in Hz). FTIR spectra were recorded with a Thermo
Nicolet 380 instrument and measured as films between NaCl plates; wave numbers are reported in cm''1.
TLC was conducted with Merck 60 F254 plates. Column chromatography was conducted with Merck silica gel
200''300 mesh. GC-MS was conducted with an Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass
spectrometer, EI voltage 70 eV, gradient from 50 to 280 °C in 30 min, column HP5 5% Ph-Me Silicon. HPLC-
MS was conducted with an Agilent Technologies HP1100 instrument, with a ZOBRAX-Eclipse XDB-C8 Agilent
Technologies column; mobile phase: H2O/CH3CN, gradient from 30 to 80% of CH3CN in 8 min, 80% of
CH3CN until 25 min, 0.4 mL/min, coupled with an Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass
spectrometer, fullscan mode from m/z = 50 to 2600, scan time 0.1 s in positive ion mode, ESI spray voltage
4500 V, nitrogen gas 35 psi, drying gas flow 11.5 mL/min, fragmentor voltage 20 V. Elemental analyses were
carried out with a Thermo Flash 2000 CHNS/O Analyzer.

Procedura generale per la sintesi dei nitrili 1-37
The chosen aldehyde (or ketone) (1 mmol) and amine (1 mmol, 0.5 mmol in the case of diamines) were
mixed in an orbital shaker at room temp. in a 5 mL vial equipped with a screw cap. After 10 min, water (4 mL)
and acetone cyanohydrin (1 mmol) were added, and the cap was closed. The mixture was stirred in an
orbital shaker for 20 h or until the reaction was complete (TLC monitoring). The reaction mixture was poured
into brine (5 mL) and extracted with EtOAc (2_10 mL), dried with Na2SO4, and concentrated. When
necessary, products were purified by flash chromatography. When the reaction was performed on a higher
scale, the workup was not necessary; the product separated from the aqueous phase when liquid or could
be recovered by filtration when solid.

Spectra of amminonitrili 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 13, 14, 19, 24, 25, 27, 30, 31, 34 (trans/cis 88/12) e 37 were consistent con those reported in the literature.

{2-[(Cyano-fenil-metil)-ammino]-fenilammino}-fenil-acetonitrile (5): Mixture of diastereoisomers, dr 95/5 determined by NMR on crude. Major
stereoisomer: pale yellow solid, mp: 98 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.07 (bs, 2H, NH), 5.39 ( s, 2H, CHCN), 7.02-7.05 (m, 2H, arom), 7.13-7.29 (m, 6H, arom),
7.36-7.42 (m, 3H arom), 7.60-7.63 (m, 2H, arom), 7.80-7.82 (m, 1H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 48.1, 110.5, 119.3, 122.8, 123.1, 125.7, 127.6, 128.6, 128.8, 129.2, 130.0, 135.4, 135.9, 142.1, 153.9; IR: ν = 3400, 2232, 1605, 1453; anal. calc. for C22H18N4: C 78.08, H
5.36, N 16.56; found: C 77.92, H 5.32, N 16.41.

{2-[(Cyano-fenil-metil)-ammino]-etilammino}-fenil-acetonitrile (6 ): Mixture of diastereoisomers, dr 50/50 determined by GC-MS analysis on
trifluoroacetamide derivatives: oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.80 (bs, 2H, 2xNH), 2.83-2.98 (m, 4H, NCH2CH2N), 4.76 (s, 2H, 2xCHCN), 7.33-7.45 (m, 10H, arom); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 46.0 (46.2 2 nd diastereoisomer), 54.1 (54.2, 2nd diastereoisomer), 118.7, 127.2, 129.0, 129.1, 134.5; IR: ν = 3330, 2223; anal. calc. for C18H18N4: C 74.46, H
6.25, N 19.30; found: C 74.41, H 6.20, N 19.20.



[4-(Cyano-fenil-metil)-piperazin-1-yl]-fenil-acetonitrile (9):
Oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.60-2.70 (m, 8H, 2x NCH2CH2), 4.88 (s, 1H, CHCN); 4.90 (s, 1H, CHCN), 7.35-7.45 (m, 6H, arom), 7.52-7.57 (m, 4H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 49.3 (broad signal), 61.9, 115.2, 127.7, 127.8, 127.9, 128.8, 128.9, 129.0,
129.1, 132.6, 132.7; IR: ν = 2224, 1600; GC-MS: rt 25.6 min, M + 316, [M+-CN] 290, 200, 116. HPLC-MS: rt 10.55 min, [M+ Na] + 339, [M+1]+ 317; anal. calc. for C20H20N4: C 75.92, H 6.37, N 17.71; found: C 76.03, H 6.44, N 17.74. H N H N Ph CN Ph NC N H H N CN Ph Ph CN N N CN Ph CN Ph Benzylammino-(2-idrossi-fenil)-acetonitrile (10): Oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.78 (bs, 1H, NH), 3.94 (d , JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 4.12 (d, JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 5.02(s, 1H, CHCN), 6.83-6.89 (m, 2H, arom), 7.19-7.37 (m, 7H,
arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 50.6, 51.5, 117.6, 120.2, 125.7, 127.5, 128.2, 128.5, 128.6, 131.0, 156.3; IR: ν = 3350, 2221, 1620; anal. calc. for C15H14N2O: C 75.61, H 5.92, N
11.76; found: C 75.58, H 5.86, N 11.83.
Benzylammino-(4-idrossi-fenil)-acetonitrile (12): Orange solid, mp: 79 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.82 (bs, 1H, NH), 3.86 (d , JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 3.97 (d , JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 4.61(s, 1H, CHCN), 6.76 (m, 2H,
arom), 7.26-7.33 (m, 7H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ =50.9, 52.6, 115.8, 118.9, 125.7, 127.5, 128.2, 128.5, 128.6, 137.6, 156.7; IR: ν = 3300, 2200, 1654, 1612, 1465; anal.
calc. for C15H14N2O: C 75.61, H 5.92, N 11.76; found: C 75.48, H 5.83, N 11.72.
Benzylammino-pyridin-2-yl-acetonitrile (16): Oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.75 (bs, 1H, NH), 3.97 (d , JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 4.04 (d, JAB = 12.8 Hz, 1H, CHHPh), 4.79(s, 1H, CHCN), 7.25-7.48 (m, 7H, arom), 7.76 (dd, 1H, J =
10.0 Hz, J = 10 Hz, arom), 8.60 (d, 1H, J = 8.0 Hz, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 51.4, 54.9, 122.0, 123.9, 127.7, 128.5, 128.6, 128.8, 137.4, 138.0, 149.9, 153.7; IR: ν = 3300, 2228,
1673; anal. calc. for C14H13N3: C 75.31, H 5.87, N 18.82; found: C 75.44, H 5.94, N 18.98. HPLC- MS: rt 7.1 min, [M+1] + 224.
2-[2-(2-Cyano-butylammino)-etilammino]-pentanenitrile (17): Mixture of diastereoisomers, dr 50/50 determined by GC-MS analysis on
trifluoroacetamide derivatives, diastereoisomer separated by flashchromatography. First stereoisomer: oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CH3), 1.47-1.59 (m, 6H, NH, CH2) 1.70-1.76 (m, 4H,
CHCH2), 2.72-2.81 (m, 2H, NCHHCHHN), 2.97-3.05 (m, 2H, NCHHCHHN), 3.51- 3.56 (m, 2H, CHCN); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 18.9, 35.3, 35.4, 46.2, 46.8, 50.0, 50.4, 120.1, 120.2; IR: ν = 3316, 2225, 1464; HPLC-MS: rt 7.02 min, [M+Na] + 245, [M+1]+ 223, [M-HCN]+ 196. anal. calc. for C12H22N4: C, 64.83; H, 9.97; N, 25.20; found: C 64.91, H 10.02, N 25.28. Second diastereoisomer: oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 6H, CH3), 1.51-1.64 (m, 6H, NH, CH2) 1.72-1.78 (m, 4H, CHCH2), 2.74-
2.82 (m, 2H, NCHHCHHN), 3.07-3.00 (m, 2H, NCHHCHHN), 3.53-3.60 (m, 2H, CHCN); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.5, 19.0, 35.4, 35.5, 46.3, 46.9, 50.1, 50.5, 120.2, 120.3; IR: ν = 3312, 2224, 1464; anal. calc. for
C12H22N4: C, 64.83; H, 9.97; N, 25.20; found: C 64.76, H 9.92, N 25.18. HPLC-MS: rt 7.05 min, [M+1] + 223, [M- HCN] + 196.
2-Allylammino-pentanenitrile (18): Yellow oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.90 (t, J = 7.6 Hz, 3H, CH3), 1.40 (bs, 1H, NH), 1.44-1.51 (m, 2H, CH2CH3), 1.68 (dt, J = 7.2 Hz, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2CH), 3.23 (ddt, J =
1.2 Hz, J = 6.4 Hz, J = 13.6 Hz, 1H, CH2CHCN), 3.43-3.49 (m, 2H, NHCH2), 5.10 (m, 1H,
CH=CHH), 5.21 (m, 1H, CH=CHH), 5.79 (m, 1H, CH=CHH); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 18.8, 35.3, 49.3, 50.1, 117.3, 120.1, 134.9; IR: ν = 3321, 2220, 1644, 1465; anal. calc. for C8H14N2: C 69.52, H 10.21, N 20.27; found: C 69.44, H 10.16, N 20.26.

2-Morpholin-4-yl-pentanenitrile (21): Yellow solid, mp: 159 °C, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.41- 1.56 (m, 2H, CH2), 1.65-1.79 (m, 2H, CH2), 2.43-2.48 (m, 2H, 2 x NCHH), 2.62-2.68 (m, 2H,
NCHH), 3.37 (t, J = 7.6 Hz, 1H, CHCN), 3.66-3.76 (m, 4H, CH2OCH2); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.2, 32.5, 50.0, 33.0, 57.9, 66.6, 116.9; IR: ν = 2223, 1455 ; anal. calc. for
C9H16N2O: C 64.25, H 9.59, N 16.65; found: C, H, N. GC-MS: rt 11.7 min, M + 168 (2), [M-15]+ 153 (1), [M-43] +, 125 (100).
2-Piperidin-1-yl-pentanenitrile (22): Oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.89 (t, J = 7.6 Hz, 3H, CH3), 1.36-1.76 (m, 10H, 5 x CH2), 2.29-2.34 (m, 2H, 2 x NCHH), 2.53-2.59 (m, 2H, NCHH), 3.37 (dd, J = 6.8 Hz, J = 8.8 Hz, 1H,
CHCN); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 19.2, 23.9, 25.7, 33.0, 50.8, 58.3, 117.3; IR: ν = 2220, 1465; HPLC-MS: rt 8.8 min, [M+H2O] + 189, [M+1]+ 167, [M-HCN]+ 140. anal. calc. for C10H18N2: C 72.24, H 10.91, N 16.85; found: C 72.35, H 10.96, N 16.80. OH NHBn CN NHBn CN HO N NHBn CN N H H N CN CN N H CN O N CN N CN 2-[4-(1-Cyano-butyl)-piperazin-1-yl]-pentanenitrile (23): Mixture of diastereoisomers, dr 80/20. Diastereoisomers were separated by
flashchromatography. Major diastereoisomer: white solid, mp: 153°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 6H, 2x CH3), 1.41-1.54 (m, 4H, 2xCH2CH)
1.65-1.80 (m, 4H, 2xCH2CH2), 2.50-2.55 (m, 4H, 2xNCHHCHHN), 2.62-2.72 (m, 4H,
2xNCHHCHHN), 3.49 (t, 2H, J = 7.6 Hz, 2xCHCN); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.2, 32.8, 49.2, 57.3, 116.9; IR: ν = 3344, 2222; anal. calc. for C14H24N4: C, 67.70; H, 9.74; N, 22.56; found: C 67.82, H 9.77, N22.58. HPLC-MS: rt 9.4 min, [M+Na] + 271, [M+1]+ 249, [M- HCN] + 222. GC-MS (rt 18.9 min) M+ 248, [M-HCN]+ 221. Minor diastereoisomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.94 (t, J = 6.8 Hz, 6H, 2xCH3), 1.44-1.52 (m, 4H, 2xCH2CH) 1.69-1.74 (m, 4H, 2xCH2CH2), 2.50-2.55 (m, 4H,
2xNCHHCHHN), 2.65-2.72 (m, 4H, 2 x NCHHCHHN), 3.48 (t, 2H, J = 7.6 Hz, 2xCHCN); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.1, 32.8, 49.3, 57.3, 116.9. HPLC-MS: rt 9.2 min, [M+1] + 249.
2-(4-Oxo-piperidin-1-yl)-pentanenitrile (26): Oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.44-1.51 (m, 2H, CH2), 1.71-1.78 (m, 2H, CH2), 2.38-2.51 (m, 4H, CH2COCH2), 2.66-2.72 (m, 2H, CHHNCHH),
2.89-2.95 (m, 2H, CHHNCHH), 3.58 (t, 1H, J = 7.6 Hz); 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 19.2, 33.3, 40.8, 49.4, 56.9, 116.6, 207.2; IR: ν = 2223, 1780, 1720; GC-MS: rt 14.0 min, M + 180 (5), [M-HCN]+ 153 (100), 137. anal. calc. for C10H16N2O: C 66.63, H 8.95, N 15.54; found: C 66.58, H 8.94, N 15.67.

2-Benzylammino-2-etil-butyronitrile (28):
Oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 6H, CH3), 1.43 (bs, 1H, NH), 1.77 (nonet, J = 7.2 Hz, 4H, CH2), 3.81 (s, 2H, CH2Ph), 7.19-7.33 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 7.6, 29.0, 48.9, 60.5, 121.8, 127.3, 128.3, 128.5, 139.4; IR: ν = 3320, 2218, 1457; anal. calc. for C13H18N2: C 77.18, H 8.97, N 13.85; found: C 77.17, H 8.91, N 13.78. HPLC-MS: rt 9.8 min, [M+1] + 203, [M-HCN] + 176.
2-Benzylammino-2-metil-hexanenitrile (29)
: Oil, 1H NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.95 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH3), 1.32-1.60 (m, 6H, NH, CH2,CH3) 1.70-1.80 (m, 2H, CH2), 3.90 (s, 2H, CH2Ph), 7.27-7.40 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.7, 22.5, 24.6, 25.8, 39.5, 49.0, 55.6, 122.1, 127.2, 18.1, 128.3, 139.1; IR: ν = 3318, 2219, 1455; anal. calc. for C14H20N2: C, 77.73; H, 9.32; N, 12.95; found: C 77.82, H 9.41, N
12.91.

1-Benzylammino-4-metil-cyclohexanecarbonitrile (33): Mixture of diastereoisomers, dr 72/38 determined from HPLC analysis on crude. Major
diastereoisomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.86 (d, J = 6.0 Hz, 3H, CH3, minor diast.), 0.88 (d, J = 6.0 Hz, 3H, CH3, major diast), 1.23-1.50 (m, 6H, NH, CH, CH2CHCH2), 1.66-1.69 (m,
2H, CHH, CHH, major diast), 1.69-1.79 (m, 2H, CHH, CHH, minor diast), 1.86-1.93 (m, 2H, CHH,
CHH, minor diast), 2.01-2.01 (m, 2H, CHH, CHH), 3.76 (s, 2H, CH2Ph, minor diast), 3.84 (s, 2H, CH2Ph, major diast), 7.19-7.28 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ =21.7, 28.0 (minor diast.), 31.1 (major diast), 31.8, 34.0 (minor diast.), 36.2 (major diast.), 48.5 (minor diast.), 48.7 (major diast), 57.7, 121.9
(major diast.), 123.0 (minor diast.), 127.2, 128.3, 128.4, 139.3; IR: ν = 3313, 2218, 1453. HPLC-MS: rt 10.4 min
(major), rt 11.1 min (minor) [M+1] + 229, [M-HCN]+ 202.
1-Benzylammino-2-metossi-cyclohexanecarbonitrile (35)
: Mixture of diastereoisomers, dr 57/43. Diastereoisomers were separated by
flashchromatography. Major diastereoisomer: oil, 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.20-1.30 (m, 1H, CH2CHH) 1.35-1.38 (m, 1H, CH2CHH), 1.48 (bs, 1H, NH),1.53-1.76 (m, 5H,
CHHCH2CH2), 2.10-2.14 (m, 1H, CHCHH), 3.38 (s, 3H, OCH3), 3.39 (dd, 1H, J = 4.4 Hz, J = 9.6
Hz, CHOCH3), 3.73 (d , JAB = 12.0 Hz, 1H, CHHPh), 3.79 (d , JAB = 12.0 Hz, 1H, CHHPh), 7.18- 7.32 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ =19.2, 23.0, 24.8, 32.3, 48.0, 57.5, 59.4, 81.8, 121.9, 127.2, 128.3, 128.4, 139.5 ; IR: ν = 3334, 2210, 1454; HPLC-MS: rt 10.6 min, [M+1] + 245, [M-HCN]+ 218.anal. calc. for C15H20N2O: C 73.74, H 8.25, N 11.47; found: C 73.64, H 8.12, N 11.31. Minor diastereoisomer: white solid, mp: 69°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.15-1.27 (m, 1H, CH2CHH), 1.29-1.42 (m, 1H, CH2CHH), 1.53-1.76 (m, 2H, CHHCH2CH2), 1.64-1.70 (m, 1H, CHCHH), 1.76-1.81 (m, 1H, CHCHH), 2.08-2.13 (m, 1H, CHCHH), 2.18-
2.22 (m, 1H, CHCHH), 2.48 (bs, 1H, NH), 3.08 (dd, 1H, J = 4.4 Hz, J = 10.8 Hz, CHOCH3), 3.31 (s, 3H, OCH3),
3.77 (d , JAB = 12.0 Hz, 1H, CHHPh), 3.84 (d , JAB = 12.0 Hz, 1H, CHHPh), 7.19-7.32 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 22.0, 23.3, 26.5, 33.6, 48.4, 56.7, 62.8, 83.4, 120.0, 127.3, 128.4, 128.5, 139.5; IR: ν = 3319, N N CN CN N O CN NC NHBn NC NHBn NHBn CN NHBn CN MeO 2219, 1456; HPLC-MS: rt 9.5 min, [M+Na] + 267, [M+1]+ 245. anal. calc. for C15H20N2O: C 73.74, H 8.25, N 11.47; found: C 73.58, H 8.14, N 11.27.

4-Benzylammino-piperidine-4-carbonitrile (36):
mp: 70°C; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.61 (ddd, 2H, J = 4.0 Hz, J = 11.2 Hz, J = 13.2 Hz, 2xCHHCH2N), 1.72 (bs, 2H, 2xNH), 1.94-2.00 (m, 2H, 2xCHHCH2N ), 2.82 (ddd, 2H, J = 2.8
Hz, J = 10.8 Hz, J = 13.6 Hz, NCHHCH2), 3.04 (ddd, 2H, J = 4.0 Hz, J = 4.4 Hz, J = 13.6 Hz, NCHHCH2), 3.85 (s, 2H, PhCH2), 7.23-7.37 (m, 5H, arom); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 36.4, 42.6, 48.2, 56.3, 121.5, 127.4, 128.3, 128.5, 139.1; IR: ν = 3313, 2218; anal. calc. for C13H17N3: C, 72.52; H, 7.96; N, 19.52;
found: C 72.61, H 8.04, N 19.41.


Parte Sperimentale relativa al paragrafo 3.3.1

Parte strumentale
Commercial reagents were used as received without additional purification. 1H and 13C NMR spectra were
recorded with an INOVA 400 or a GEMINI 200 instrument with a 5 mm probe. All chemical shifts were
calibrated to deuterated sol- 416 vent signals; δ values are quoted in ppm units, and J values are quoted in
Hz. Polarimetric Analyses were conducted with a Unipol L 1000 ''Schmidt''Haensch' Polarimeter at 598 nm.
FTIR spectra: Thermo Nicolet 380 instrument, measured as films between NaCl plates; wavenumbers are
reported in cm''1. TLC: Merck 60 F254 421 plates. Column chromatography: Merck silica gel 200''300 mesh.
GC''MS: Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, EI voltage 70 eV, gradient
from 50 to 280 °C in 30 min, column HP5 5% Ph-Me Silicone. HPLC''MS: Agilent Technologies HP1100
instrument, equipped with a ZOBRAX- 426 Eclipse XDB-C8 Agilent Technologies column; mobile phase: H2O/
CH3CN, 0.4 mL/min, gradient from 30 to 80% of CH3CN in 8 min, 80% CH3CN until 25 min, coupled with an
Agilent Technologies MSD1100 single-quadrupole mass spectrometer, full scan mode from m/z = 50 to 2600,
scan time 0.1 s in positive-ion mode, ESI 431 spray voltage 4500 V, nitrogen gas 35 psi, drying gas flow 11.5
mL/min, fragmentor voltage 20 V. Elemental analyses: Thermo Flash 2000 CHNS/O Analyzer. Single-crystal X-
ray diffraction data were collected at room temperature with an Oxford Diffraction Xcalibur
diffractometer equipped with a Mo-Kα radiation source (λ = 436 0.71073 ') and a Sapphire3 CCD detector.
The structure was solved using SHELXS-97 (altro) or SIR-92 (iodioderiv) programs; SHELXL-97 was used for
structural refinement.

Dati relativi alle strutture a raggi X
Crystal Data for 78a:
C22H26N2O, M = 334.45, space group: C2 (monoclinic), a = 19.665(4), b = 6.4176(13), c
= 16.037(5) ', β = 441 102.86°(3), V = 1973.2(8) '3, Z = 4, Dc = 1.126 gcm''3, λ (Mo-Kα) = 0.069 mm ''1, T = 293(2) K, 6912 reflections collected, 1914 unique (Rint = 0.0757), 1010 reflections with I _ 2s(I), 231
parameters, R1 = 0.0575, wR2 (all data) = 0.1721. CCDC reference number: 894335. 446

Crystal Data for 83a:
C14H15IN2O2, M = 370.18, space group: P21 (monoclinic), a = 5.7970(15), b =
15.367(5), c = 8.313(3) ', β = 90.950°(3), V = 740.4(4) '3, Z = 2, Dc = 1.660 gcm ''3, λ (Mo-Kα) = 2.162 mm''1, T = 293(2) K, 2682 reflections collected, 1885 unique (Rint = 0.0312), 1597 reflections with I _ 2s(I), 161 param-
451 eters, R1 = 0.0505, wR2 (all data) = 0.1378. CCDC reference number: 894334.


Procedura generale per la sintesi dei nitrili:
The chosen aldehyde (1 mmol) and amine (1 mmol) were mixed in an orbital shaker at room temp. in a 5 mL
vial equipped with a screw cap. After 10 min, water (4 mL) and acetone cyanohydrin 461 (1 mmol) were
added, and the cap was closed. If the amine was used as its hydrochloride, triethylamine (1 mmol) was
added prior to the addition of the aldehyde. The mixture was stirred in an orbital shaker for 20 h. The
reaction mixture was poured into brine (5 mL) and extracted with CH2Cl2 (2_ 10 mL), then the combined
extracts were dried with Na2SO4 and concentrated. If necessary, the products were purified by flash
chromatography. Diastereomeric
ratios were determined from 1H NMR spectra or HPLC data of the crude material.

(2-(-2-idrossi-1-feniletil)ammino)pentanenitrile (51): Major diastereoisomer separated by flash-chromatography, minor isomer
characterized in the crude. 51a (2R, 2''S) major isomer: yellow syrup; [α]D 25 HN NHBn CN Ph N H Pr CN Ph N H Pr CN HO HO +157.37 (c 0.64, CH2Cl2); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.92 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3), 1.48-1.58 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.74-1.79 (dt, J = 7.2, 7.2 Hz, 2 H, CH3CH2CH2), 2.34 (brs, 2 H, OH e NH), 3.30 (t, J = 7.2, 1 H,
CHCN), 3.61 (dd, J = 9.6, 11.2 Hz, 1 H, CHHOH), 3.80 (dd, J = 4.0, 11.2 Hz, 1 H, CHHOH), 4.13 (dd, J = 4.0, 9.6
Hz, 1 H, CHPh), 7.28-7.39 (m, 5 H, ArH) ppm; 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 18.9, 35.6, 47.7, 63.1, 67.2, 120.1, 127.7, 128.3, 128.8, 138.1 ppm; IR 3415, 3325, 2962, 2932, 2227, 1065 cm ''1.C13H18N2O (218.29): calcd. C 71.53, H 8.31, N 12.83; found C 71.99, H 8.45, N 12.72. HPLC-MS: Rt = 7.35 min, m/z = 219 [M + H] +, 241 [M + Na] +. (51b) (2S,2''S) minor isomer: yellow syrup; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.95 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3), 1.48-1.58 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.69-1.78 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 2.46 (brs, 2 H, OH e NH), 3.55-3.88 (m, 3 H,
CHCN, CH2OH ), 3.99 (dd, J = 4.4, 7.6 Hz, 1 H, CHPh), 7.28-7.39 (m, 5 H, ArH) ppm. HPLC-MS: Rt = 6.51 min,
m/z = 219 [M +H] +, 241 [M + Na]+.
2-((-2-metossi-1-feniletil)ammino)-2-fenilacetonitrile (53):
Characterized as diastereomeric mixture, signal refer to major
diastereosiomer, only main signals of minor one are reported. 53a (2R, 2''S)
major isomer + 53b (2S, 2''S) minor isomer. Orange oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.33 (s, 3 H, OCH3 minor isomer), 3.40 (s, 3 H, OCH3), 3.46-3.54 (m, 2 H, CH2OMe), 3.96 (dd, 1 H, J = 3.2, 8.8 Hz, PhCHCH2O, minor) 4.40 (dd, J = 5.6, 8.0 Hz, 1 H, PhCHCH2O),
4.49 (s, 1 H, CHCN), 4.71 (s, 1 H, CHCN, minor), 7.27-7.43 (m, 6 H, ArH), 7.50-7.54 (m, 4 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 51.8, 58.6, 60.6, 76.9, 118.6, 127.2, 127.8, 128.4, 128.7, 128.8, 128.9, 135.1, 138.1 ppm. IR: ν' = 3325, 2890, 2228, 1108 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 9.68 min, minor isomer, m/z = 240 [M '' CN]+, 267 [M + 1] +; Rt = 10.19 min, major isomer, m/z = 240 [M '' CN]+, 267 [M + 1]+.
2-((2-metossi-1-feniletil)ammino)pentanenitrile (54): Characterized as diastereomeric mixture, signals refer to major
diastereosiomer, only main signals of minor one are reported. 54a (2R,2''S)
major isomer + 54b (2S, 2''S) minor isomer. Orange oil 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3 ), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3 minor) 1.49-1.55 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.63-1.69 (m, 2 H, CH3CH2 CH2, minor), 1.71-1.78 (m, 2 H, CH3CH2 CH2), 3.25
(t, J = 7.2 Hz, 1 H, CHCN), 3.36-3.44 (m, 2 H, CH2OMe), 3.41 (s, 3 H, OCH3), 3.76 (t, J = 6.8 Hz, 1 H, CHCN), 4.13
(dd, J = 3.6, 7.6 Hz, 1 H, CHPh), 4.25 (dd, J = 5.2, 8.0 Hz, 1 H, CHPh), 7.28-7.39 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.5, 18.9, 35.8, 47.5, 58.6, 60.2, 77.0, 120.3, 127.7, 128.2, 128.7, 138.4 ppm. IR: ν' = 3326, 2962, 2930, 2225, 1689, 1455, 1118 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 9.13 min, minor isomer, m/z = 233[M + H]+, 438 [2M '' CN] +; Rt = 9.68 min, major isomer, m/z = 233[M + H]+, 438 [2M '' CN]+.
Metil 2-((cyano(fenil)metil)ammino)-2-fenilacetate (55):
Characterized as diastereomeric mixture. Yellow oil. 55a (2R,S) major
isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.78 (dd, J = 3.6, 10.4 Hz, 1 H, NH), 3.71 (s, 3 H, CH3), 4.50 (d, J = 10.4, 1 H, PhCHCO2), 4.77 (d, J = 3.6,
1 H, CHCN), 7.35-7.55 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 51.7, 52.7, 63.2, 118.2, 127.3, 128.1, 128.8, 128.9, 129.0, 129.2, 134.2, 136.1, 171.7 ppm. IR: ν' = 3327,
2252, 1739, 1453 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 9.00 min, m/z = 254 [M '' CN]+, 276 [M '' HCN + Na]+, 281 [M + H]+, 303 [M + Na] +, 319 [M + K]+. 55b (2S, S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.54 (dd, J = 6.4, 6.8 Hz, 1 H, NH), 3.74 (s, 3 H, CH3), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 1 H, PhCHCO2), 4.87 (d, J = 6.8 Hz, 1 H, CHCN), 7.35-7.55 (m, 5 H, ArH) ppm. IR: ν' = 3327, 2252, 1453 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 8.83 min, m/z = 254 [M '' CN]+, 276 [M '' HCN + Na] +, 281 [M + H]+, 303 [M + Na]+, 319 [M + K]+.
Metil 2-((1-cyanobutyl)ammino)-2-fenilacetate (56): Characterized as diastereomeric mixture. Yellow oil. 56a (2R,S) major
isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ =0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2), 1.47''1.62 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.74-1.80 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 2.45 (d,
J = 11.6 Hz, 1 H, NH), 3.25 (dt, J = 6.8, 11.6 Hz, 1 H, CHCN), 3.71 (s, 3H, CO2CH3), 4.64 (s, CHPh, 1 H), 7.33-7.43 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 18.8, 35.4, 47.4, 52.7, 63.2, 119.7, 128.1, 128.8, 128.9, 137.1, 171.9 ppm. IR: ν' = 3331, 3031, 2960, 2875, 2253, 2226,
1739, 1455, 1436 cm ''1. HPLC-MS: Rt 8.62 min, m/z = 220 [M '' CN]+, 247 [M + 1]+, 269 [M + Na]+, 285 [M + K]+. 56b (2R, S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ =0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2), 1.47''1.62 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.74-1.80 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 2.04 (br s, 1 H, NH, minor diast.), 3.72 (s, 3H, CO2CH3), 3.68-3.76
(m, 1 H, CHCN), 4.65 (s, PhCH, 1 H), 7.33-7.43 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 18.8, 35.5, 48.8, 52.7, 63.3, 119.8, 127.6, 128.6, 128.7, 136.3, 172.3 ppm. HPLC-MS: Rt 8.32 min m/z = 220 [M ''
CN] +, 247 [M + H]+, 269 [M + Na]+, 285 [M + K]+. Ph N H Ph CN Ph N H Ph CN MeO MeO Ph N H Pr CN Ph N H Pr CN MeO MeO Ph N H Ph COOMe CN Ph N H Ph COOMe CN Pr N H Ph COOMe CN Pr N H Ph COOMe CN Metil 2-((cyano(fenil)metil)ammino)-3-fenilpropanoate (57). Characterized as diastereomeric mixture. Pale yellow oil. HPLC-MS: Rt
9.40 min (major + minor) m/z 268 [M '' CN] +, 290, 295 [M + H]+, 317 [M + Na] +, 333 [M + K]+. 57a (2R, S) major isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.42 (bs, 1 H, NH), 2.96 (dd, J = 8.4, 13.6 Hz, 1 H, PhCHHCH), 3.12 (dd, J = 5.2, 13.6 Hz, 1 H, PhCHHCH), 3.70 (dd, J = 5.2, 8.4 Hz, 1 H, CHCH2Ph), 3.75 (s, 3 H,
CH3), 4.58 (s, 1 H, CHCN), 7.19-7.56 (m, 10 H, ArH) ppm. 13C (100 MHz, CDCl3): δ = 39.7, 52.2, 52.9, 60.4, 118.6, 126.9, 127.4, 128.5, 128.9, 129.1, 129.3, 134.3, 136.8, 173.6. IR: ν' = 3328, 2952, 2925, 2293, 2229,
1736 cm ''1. 57b (2S, S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.10 (bs, 1 H, NH), 2.93-3.00 (m, 1H, PhCHH), 3.14 (dd, J = 5.6, 14.0 Hz, 1 H, PhCHH), 3.79 (s, 3 H, CH3), 3.88 (dd, J = 5.6, 8.0 Hz, 1 H, CHCH2), 4.88
(s 1 H, CHCN), 7.19-7.56 (m, 10 H, ArH.) ppm. 13C (100 MHz, CDCl3): δ = 39.4, 52.1, 53.3, 59.6, 118.4, 127.1, 127.5, 128.6, 129.0, 129.1, 129.2, 134.2, 136.2, 173.6.

Metil 2-((1-cyanobutyl)ammino)-3-fenilpropanoate (58): Diastereoisomers separated by flash-chromatography. 58a (1''R,S)
major isomer: pale yellow oil; [α]D 20 = +292.6 (c = 1.25, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 1 H, CH3CH2CH2), 1.40-1.49 (m,
2 H, CH2), 1.57-1.69 (m, 2 H, CH2), 2.03 (dd, J = 7.7, 10.4 Hz, 1 H, NH), 2.86 (dd, J = 7.6, 13.6 Hz, 1 H, CHHPh), 3.02 (dd, J = 5.6, 13.6 Hz 1 H, CHHPh), 3.27 (dt, J = 7.2, 10.4 Hz, 1 H,
CHCN), 3.62 (ddd, J = 5.6, 7.6, 7.7 Hz, 1 H, CH2CHNHCO2Me), 3.74 (s, 3H, CH3), 7.17-7.31 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 18.7, 35.7, 39.8, 49.4, 52.1, 61.2, 119.9, 126.8, 128.4, 129.3, 136.9,
173.7 ppm. IR: ν' = 3328, 3002, 2874, 2225, 1956, 1888, 1737, 1205 cm ''1.C15H20N2O2 (260.33): calcd. C 69.20; H 7.74; N 10.76; found C 69.25, H 7.81, N 10.68. HPLC-MS: Rt = 9.16 min, m/z = 261 [M + 1] +, 283 [M + Na]+. 58b (1''S, S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 1 H, CH3CH2CH2), 1.40-1.49 (m, 2 H, CH2), 1.57-1.69 (m, 2 H, CH2), 21.81 (brs, 1 H, NH), 2.92 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, 1 H, CHHPh), 3.12 (dd, J = 5.6,
14.0 Hz 1 H, CHHPh), 3.70-3.76 (m, 1 H, CHCN), 3.72 (s, 3H, CH3), 3.81-3.86 (m 1 H, CH2CHNHCO2Me), 7.17-
7.31 (m, 5 H, ArH) ppm. HPLC-MS: Rt = 8.90 min, m/z = 261 [M + 1] +, 283 [M + Na]+
2-((1-idrossi-3-fenilpropan-2-yl)ammino)-3-metilbutanenitrile (59): Characterized as diastereomeric mixture enriched in the minor
stereoisomer after flashchromatography . Pale yellow oil. 59a (2R, 1''S)
major isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.98-1.03 (m, 6 H, CH(CH3)2), 1.90-1.96 (m, 1 H, CH(CH3)2), 2.65 (dd, J = 7.2, 13.2 Hz, 1 H, CHCHHPh), 2.77 (dd, J = 6.0, 13.2 Hz, 1 H, CHCHHPh), 3.09-3.16 (m, 1 H, CH2CHCH2), 3.30 (d, J = 5.6 Hz, 1 H,
CHCHCN), 3.42 (dd, J = 7.2, 11.2 Hz, 1 H, CHCHHOH ), 3.74 (dd, J = 4.0, 11.2 Hz, 1 H, CHCHHOH), 7.24-7.39 (m,
5 H, ArH) ppm. HPLC-MS: Rt = 7.22 min, major isomer, m/z = 206 [M '' CN] +, 233 [M + H]+, 255 [M + Na]+. 59b (2S, 1''S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.00 (d, J = 6.8 Hz, 3 H, CH3CHCH3, 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3 H, CH3CHCH3), 1.61 (bs, 1 H, OH), 1.88-1.99 (m, 1 H, CHCH(CH3)2), 2.14 (bs, 1 H, NH), 2.80 (dd, J = 8.4, 13.6 Hz,
1 H, CHCHHPh), 2.94 (dd, J = 6.0, 13.6 Hz, 1 H, CHCHHPh), 3.17-3.22 (m, 1 H, CH2CHCH2), 3.43-3.47 (m, 2 H,
CHCHHOH + CHCHCN), 3.66 (dd, J = 3.2, 11.2 Hz, 1 H, CHCHHOH), 7.24-7.39 (m, 5 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 17.9, 19.1, 31.7, 38.0, 54.9, 58.1, 61.9, 119.1, 126.9, 128.8, 129.2, 137.2 ppm. IR: ν' = 3442,
3338.7, 2963, 2929, 2227, 1120 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 6.87 min, m/z = 206 [M '' CN]+, 233 [M + H]+, 255 [M + Na] +.
2-((1-idrossi-3-(1H-indol-2-yl)propan-2-yl)ammino)-3-metilbutanenitrile (60): Characterized as diastereomeric mixture. Pale yellow oil. 60a (2R, 1''S)
major isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.98-1.00 (m, 6 H, CH(CH3)2), 1.68-2.04 (bs, 2 H, OH + NHCHCN), 1.86-1.97 (m, 1 H,
CHCH(CH3)2), 3.01 (ddd, J = 0.8, 8.0, 14.4 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.07 (ddd, J = 0.8, 8.4, 14.4 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.28-3.34 (m, 1 H, CH2CHCH2), 3.46-3.53 (m, 2 H, CHCHCN +
CHCHHOH), 3.70 (dd, J = 3.6, 10.8 Hz, 1 H, CHCHHOH), 7.06-7.25 (m, 3 H, ArH), 7.37-7.40 (m, 1 H, ArH), 7.62-
7.66 (m, 1 H, ArH), 8.09 (bs, 1 H, NHInd, minor), 8.14 (bs, 1 H, NHInd). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 17.8, 19.1, 26.8, 31.8, 55.2, 57.6, 62.4, 111.2, 111.4, 118.7, 119.5, 119.6, 122.2, 122.5, 127.4, 136.2. IR: ν' = 3412,
3057, 2228, 1457, 1031 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 7.66 min, m/z = 245 [M '' CN]+, 294 [M + Na]+. 60b (2S,1''S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.98-1.00 (m, 6 H, CH(CH3)2), 1.68-2.04 (bs, 2 H, OH + NHCHCN), 1.86-1.97 (m, 1 H, CHCH(CH3)2), 2.81(ddd, J = 0.8, 3.6, 14.4 Hz, 1 H, IndCHHCH), 2.96 (ddd, J = 0.8, 6.0, 14,4
Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.23-3.29 (m, 1 H, CH2CHCH2), 3.46-3.53 (m, 2 H, CHCHCN + CHCHHOH), 3.77 (dd, J = 3.6,
10.8 Hz, 1 H, CHCHHOH), 7.06-7.25 (m, 3 H, ArH), 7.37-7.40 (m, 1 H, ArH), 7.62-7.66 (m, 1 H, ArH), 8.09 (bs, 1
H, NHInd) 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 17.9, 19.2, 27.4, 31.7, 55.3, 58.4, 64.3, 111.2, 111.8, 118.7, 119.5, 119.8, 122.3, 122.6, 127.6, 136.3. HPLC-MS: Rt = 7.35 min, m/z = 245 [M '' CN] +, 294 [M + Na]+. N H Ph COOMe CN N H Ph COOMe CN Ph Ph N H Pr COOMe CN N H Pr COOMe CN Ph Ph N H CN N H CN Ph Ph OH OH N H CN N H CN Ind Ind OH OH
Metil 2-(-1-cyanobutyl)ammino)-3-(1H-indol-2-yl)propanoate (62): Characterized as diastereomeric mixture. Pale yellow oil. 62a (1''R, S)
major isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.39-1.53 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.64-1.70 (m, 2 H, CH3
CH2CH2CH), 1.74 (bs, 1 H, CHNHCHCN), 3.10 (ddd, J = 0.8, 7.2, 14.8 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.21 (ddd, J = 0.8, 5.2, 14.8 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.41 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, CH2CHCN), 3.71-3.76 (m, 1 H, CH2CHCOMe), 3.71 (s, 3 H, CO2Me), 7.07-7.24 (m, 3 H, ArH), 7.35-7.39 (m, 1 H, ArH), 7.61-7.64 (m, 1
H, ArH), 8.08 (bs, 1 H, NHInd). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.2, 18.6, 28.9, 35.3, 48.9, 52.1, 60.5, 110.8, 111.1, 118.6, 119.6, 119.9, 122.1, 122.8, 127.3, 136.0, 174.1. IR: ν' = 3445, 2977, 2227, 1736, 1494, 1155.
HPLC-MS: Rt = 8.78 min, m/z = 273 [M '' CN] +, 300 [M + H]+, 322 [M + Na]+. 62b (1''R, S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.90 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.39-1.53 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.64-1.70 (m,
2 H, CH3 CH2CH2CH), 2.09 (bs, 1 H, CHNHCHCN), 3.15 (ddd, J = 0.8, 8.4, 14.4 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.31 (ddd, J
= 0.8, 4.8, 14.8 Hz, 1 H, IndCHHCH), 3.66 (t, J = 6.8 Hz, 1 H, CH2CHCN), 3.73 (s, 3 H, CO2Me), 3.96 (dd, J = 5.2,
8.4 Hz, 1 H, CH2CHCOMe), 7.07-7.24 (m, 3 H, ArH), 7.35-7.39 (m, 1 H, ArH), 7.61-7.64 (m, 1 H, ArH), 8.12 (bs,
1 H, NHInd). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 18.7, 29.2, 35.7, 49.3, 52.1, 59.4, 110.3, 111.2, 118.6, 119.5, 119.9, 122.3, 122.7, 127.3, 136.2, 173.8. HPLC-MS: Rt = 8.63 min, m/z = 273 [M '' CN] +, 300 [M + H]+, 322 [M + Na] +.
Metil 1-(cyano(fenil)metil)pyrrolidine-2-carboxylate (70): Diastereoisomers separated by flash-chromatography. 70a (S, 1S) major
isomer: yellow oil; [α]D 20 = -94.06 (c = 0.64, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.79-1.87 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 2.06-2.14 (m, 1 H,
CHHCHCO2Me), 2.21-2.31 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.55 (dt, J = 8.8, 8.8 Hz,
1 H, CH2CHHN), 2.72-2.76 (m, 1 H, CH2CHHN), 3.61 (dd, J = 7.2, 9.2 Hz, 1 H, CHHCHCO2Me), 3.80 (s, 3 H, CH3), 5.37 (s, 1H, CHCN), 7.35''7.43 (m, 3 H, ArH), 7.57-7.60 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 22.8, 28.8, 48.2, 52.1, 58.1, 63.0, 116.0, 127.6, 128.7, 128.8, 133.8, 173.3
ppm. IR: ν' = 2953, 2227, 1743, 1206 cm ''1.C14H16N2O2 (244.29): calcd. C, 68.83; H, 6.60; N, 11.47; found C 69.02, H 6.71, N 11.57. HPLC-MS: Rt = 8.37 min, m/z = 245 [M + H] +, 267 [M + Na]+. 70b (S, 1R) minor isomer: yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.58-1.98 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 2.00-2.09 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.12-2.22 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.91-2.99 (m, 1 H, CHHN), 3.32 (s, 3 H, CH3), 3.33-3.38 (m, 1 H, CH2CHHN), 3.48 (dd, J = 4.0, 9.2 Hz, 1 H,CH2CHCO2Me), 5.17 (s, 1H, CHCN), 7.35''7.41 (m, 3 H, ArH), 7.45-7.52 (m, 2 H,
ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 23.9, 30.4, 51.6, 53.1, 58.7, 61.0, 116.6, 128.3, 128.6, 129.1, 132.9, 174.0 ppm. HPLC-MS: Rt = 7.27 min, m/z = 245 [M + 1] +, 267 [M + Na]+.
Metil 1-(1-cyanobutyl)metil)pyrrolidine-2-carboxylate (71): Major diastereoisomer separated by flash-chromatography, minor one
characterized in the crude. 71a (S, 1S) major isomer: pale yellow oil;
[α]D 20 = -64.37 (c = 1.4, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.43-1.60 (m, 2 H, CH3CH2), 1.70-1.82 (m, 2 H,
CH2CH2CH2), 1.87-1.94 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.99-2.07 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.12-2.22 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.59 (dt, J = 8.8, 8.4 Hz, 1 H, CHHN), 3.11 (ddd, J = 4.4, 6.4,
8.8 Hz, 1H, CHHN), 3.43 (dd, J = 6.4, 8.4 Hz, 1 H, CHCO2Me), 3.73 (s, 3 H, CH3), 3.97 (t, J = 7.6 Hz, 1 H, CHCN) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 19.2, 23.0, 28.6, 34.4, 47.9, 52.0, 54.0, 63.5, 117.8, 173.3 ppm. IR: ν' = 2960, 2876, 2223, 1747, 1175 cm ''1.C11H18N2O2 (210.14): calcd. C, 62.83; H, 8.63; N, 13.32; found C 62.78, H 8.71, N 13.48. HPLC-MS: Rt = 7.49 min, m/z = 130 [M '' CH3(CH2)2CHCN + 2] +, 211[M + 1]+. 71b (S, 1R) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.94 (t, J = 8.0 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.43-1.60 (m, 2 H, CH3CH2), 1.70-1.82 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 1.87-1.94 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.99-2.07 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.12-2.22
(m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.80-2.87 (m, 1 H, CHHN), 3.19-3.24 (m, 1H, CHHN), 3.56 (dd, J = 4.0, 12.0 Hz, 1 H,
CHCO2Me), 3.76-3.81 (m, 1 H, CHCN), 3.82 (s, 3 H, CH3) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.3, 24.1, 29.2, 34.7, 47.9, 51.9, 3.7, 63.5, 118.2, 175.0 ppm. HPLC-MS: Rt = 6.92 min, m/z = 211[M + H] +.
Tert-butyl 1-(cyano(fenil)metil)pyrrolidine-2-carboxylate (72). Diastereoisomers separated by flash- chromatography. 72a (S, 1S) major isomer: pale yellow oil; [α]D 20 = -54.53 (c = 0.27, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.52 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.78-1.84 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 2.02-2.10 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.16-
2.25 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.54 (dt, J = 7.6, 9.2 Hz, 1 H, CH2CHHN),
2.71 (ddd, J = 4.4, 6.0, 9.2 Hz, 1 H, CHHN), 3.48 (dd, J = 6.8, 8.8 Hz, 1 H, CHCO2tBu), 5.39 (s, 1H, CHCN), 7.34''7.43 (m, 3 H, ArH), 7.58-7.61 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 22.7, 28.1, 28.8, 48.2, 58.2, 63.6, 81.4, 116.2, 127.6, 128.7 (2xC), 134.1, 171.9 ppm. IR: ν' = 2959, N H Pr COOMe CN N H Pr COOMe CN Ind Ind N COOMe Ph CN N COOMe Ph CN N COOMe Pr CN N COOMe Pr CN N COOtBu Ph CN N COOtBu Ph CN 2874, 2227, 1735, 1010 cm ''1. C17H22N2O2 (286.37): calcd. C, 71.30; H, 7.74; N, 9.78; found C, 71.53, H 7.86, N 9.84. HPLC-MS: Rt = 10.88 min, m/z = 172 [M '' tbu - CN + 3] +, 260 [M - CN]+, 287 [M + 1]+, 309 [M + Na]+, 325 [M + K] +. 72b (S, 1R) minor isomer: pale yellow oil; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.57 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.82- 1.89 (m, 1 H, CH2CHHCH2), 1.92-1.98 (m, 1 H, CH2CHHCH2), 1.99-2.07 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.09-2.18 (m, 1
H, CHHCHCO2Me), 2.54 (dt, J = 6.4, 9.2 Hz, 1 H, CH2CHHN), 3.35-3.40 (m, 2 H, CHHN, CHCO2tBu), 5.16 (s, 1H,
CHCN), 7.35''7.39 (m, 3 H, ArH), 7.52-7.54 (m, 2 H, ArH) ppm. HPLC-MS: Rt = 10.09 min, m/z = 172 [M '' tbu -
CN + 3] +, 260 [M - CN]+, 287 [M + 1]+, 309 [M + Na]+, 325 [M + K]+.
Tert-butyl 1-(1-cyanobutyl)pyrrolidine-2-carboxylate) (73): Characterized as diastereomeric mixture. Pale yellow oil. IR: ν' = 2964,
2933, 2223, 1739, 1150, 1100 cm ''1. 73a (S,1S) major isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ =0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3 H, CH3CH2CH.), 1.47 (s, 9 H,
C(CH3)3), 1.49-1.59 (m, 4 H, CH2CH2CH3), 1.74-1.81 (m, 1 H, CHHCH2N),
1.82-1.91 (m, 1 H, CHHCH2N), 1.94-2.02 (m, 1 H, CHHCHCOOCH3), 2.07- 2.15 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.57 (dt, J = 8.0, 8.8 Hz, 1 H, CHHN), 3.07-3.12 (m, 1 H, CHHN), 3.29 (dd, J = 6.8,
8.8 Hz, 1 H, CHCO2CH3), 3.99 (t, J = 7.6 Hz, 1 H, CHCN) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.3, 22.9, 28.1, 28.6, 34.5, 47.9, 54.1, 64.2, 81.2, 118.1, 171.9 ppm HPLC-MS: Rt = 10.26 min, m/z = 275 [M + Na] +. 73b (S, 1R) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ =0.94 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH.), 1.46 (s, 9 H, C(CH3)3), 1.49-1.59 (m, 4 H, CH2CH2CH3), 1.74-1.81 (m, 1 H, CHHCH2N), 1.82-1.91 (m, 1 H, CHHCH2N), 1.94-2.02 (m, 1 H, CHHCHCOOCH3), 2.07-2.15 (m, 1 H, CHHCHCO2CH3), 2.77-2.83 (m, 8.8 Hz, 1 H, CHHN), 3.18-3.22 (m, 1 H,
CHHN), 3.39 (dd, J = 3.2, 9.6 Hz, 1 H, CHCO2CH3), 3.78 (dd, J = 6.4, 9.6 Hz, 1 H, CHCN) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.4, 24.3, 27.9, 29.7, 35.0, 47.9, 55.7, 64.2, 80.8, 118.5, 174.0 ppm. HPLC-MS: Rt =
9.68 min, m/z = 275 [M + Na] +.
Benzyl 1-(cyano(fenil)metil)pyrrolidine-2-carboxylate (74)
: Diastereoisomers separated by flash-chromatography. 74a (S, 1S) major
isomer: pale yellow oil; [α]D 20 = -65.20 (c = 1.19, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.58-1.87 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 2.09-2.18 (m, 1 H,
CHHCHCO2Bn), 2.21-2.31 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 2.59 (dt, J = 8.0, 8.4 Hz,
1 H, CH2CHHN), 2.70-2.75 (m, 1 H, CH2CHHN), 3.65 (dd, J = 6.8, 8.8 Hz, 1 H, CHHCHCO2Bn), 5.21 (d, JAB = 12.4, 1 H, CHHPh), 5.26 (d, JAB = 12.4, 1 H, CHHPh), 5.35 (s, 1H, CHCN), 7.35- 7.41 (m, 8 H, ArH), 7.50-7.52 (m, 2H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 22.8, 28.6, 48.1, 58.0, 62.9, 66.6, 115.9, 127.4, 128.2, 128.3, 128.5, 128.6, 128.7, 133.7, 135.5, 172.4 ppm. IR: ν' = 3064, 3033, 2926,
2850, 2227, 1956, 1888, 1743, 1175 cm ''1. C20H20N2O2 (320.38): calcd. C 74.98, H 6.29, N 8.74; found C75.07, H 6.34, N 8.69. HPLC-MS: Rt = 10.86 min, m/z = 321 [M + H] +, 343 [M + Na]+. 74b (S, 1R) minor isomer: pale yellow oil; [α]D 20 = -17.93 (c = 0.99, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.88-1.99 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 2.01-2.08 (m, 1 H, CHHCHCO2Bn), 2.10-2.22 (m, 1 H, CHHCHCO2Bn), 2.98 (dt, J = 6.8, 8.8 Hz, 1 H, CH2CHHN),
3.37 (dt, J = 2.8, 8.8 Hz, 1 H, CHHN), 3.52 (dd, J = 4.0, 9.6 Hz, 1 H, CHHCHCO2Bn), 4.71 (d, JAB = 12.0 Hz, 1 H,
CHHPh), 4.80 (d, JAB = 12.4 Hz, 1 H, CHHPh), 5.17 (s, 1 H, CHCN), 7.18-7.20 (m, 2 H, ArH), 7.31-7.39 (m, 6 H,
ArH), 7.46-7.51 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 23.8, 30.4, 52.8, 58.4, 60.9, 66.1, 116.7, 128.0, 128.1, 128.2, 128.3, 128.5, 128.9, 132.9, 135.4, 173.3 ppm. IR: ν' = 3064, 3033, 2952, 2828, 2226,
1743, 1166 cm ''1. C20H20N2O2 (320.38): calcd. C 74.98, H 6.29, N 8.74; found C 75.21, H 6.44, N 8.61.HPLC-MS: Rt = 9.98 min, m/z = 321 [M + H] +, 343 [M + Na]+, 359 [M + K] +.
2-(2-(idrossimetil)pyrrolidin-1-yl)-2-fenilacetonitrile (75): Characterized as diastereomeric mixture. Signals refer to major
diastereosiomer, only main signals of minor one are reported. Pale yellow
oil 75a (2S, 2''S) major isomer + 75b (2R, 2''S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.67-1.74 (m, 1 H, NCH2CH2CHHCH), 1.76-1.87 (m, 2 H,
CH2CHHCH2, NCH2CH2CHHCH), 1.99-2.04 (m, 1 H, CH2CHHCH2), 2.15 (bs, 1 H, OH), 2.62 (dt, J = 8.8, 9.6 Hz, 1 H, CH2CHHN), 2.68-2.73 (m, 1 H, CHHN), 2.88-2.95 (m, 1H, minor), 3.00-
3.04 (m, 1H, minor), 3.11-3.16 (m, 1 H, CHCH2OH), 3.61 (dd, J = 3.6, 11.2 Hz, 1 H, CHCHHOH), 3.82 (dd, J =
3.2, 11.2 Hz, 1 H, CHCHHOH), 5.11, (s, 1H, CHCN minor), 5.27 (s, 1 H, CHCN), 7.37-7.42 (m, 3 H, ArH), 7.43-
7.52 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 23.1, 27.5, 49.2, 57.9, 62.6, 63.2, 116.3, 127.5, 128.7, 128.8, 134.1 ppm. IR: ν' = 3424, 3063, 3033, 2924, 2875, 2227, 1602, 1452, 1077 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 5.36 min, minor isomer, m/z = 190 [M '' CN] +; Rt = 6.38 min, major isomer, m/z = 217 [M + H]+, 190 [2M '' CN]+. Compound 75a was obtained also starting from 70a through reduction of ester function con NaBH4 (see
electronic supplementary information for details).

2-(2-(idrossimetil)pyrrolidin-1-yl)pentanenitrile (76). N COOtBu Pr CN N COOtBu Pr CN N COOBn Ph CN N COOBn Ph CN N Ph CN N Ph CN OH OH Characterized as diastereomeric mixture. Signals refer to major
diastereosiomer, only main signals of minor one are reported. Pale yellow
oil. 76a (2S, 2''S) major isomer + 76b (2R, 2''S) minor isomer: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.46-1.56 (m, 2 H,
CH3CH2CH2), 1.71-1.87 (m, 4 H, CH3CH2CH2, CH2CH2CH2), 1.92-1.98 (m, 2 H, CH2CH2CH2CH), 2.63 (dt, J = 6.8, 8.8 Hz, 1 H, CH2CHHN), 2.7-2.83 (m, 1H, minor), 2.92-2.97 (m, 1 H,
CHCH2OH), 3.03-3.08 (m, 1 H, CH2CHHN), 3.11-3.17 (m, 1H, minor), 3.46 (ddd, J = 3.6, 8.8, 12.0, 1 H, CHCHHOH), 3.63 (ddd, J = 2.8, 2.8, 12.0 Hz, 1 H, CHCHHOH), 3.72 (dd, J = 6.0, 9.2 Hz 1H, CHCN minor), 3.83
(dd, J = 7.6, 8.0 Hz, 1 H, CHCN) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.4, 19.3, 23.4, 27.2, 34.7, 48.7, 53.5, 62.5, 62.8, 118.0 ppm. IR: ν' = 3423, 2962, 2960, 2875, 2224, 1640, 1043 cm ''1
(S)-2-((S)-2-(idrossidifenilmetil)pyrrolidin-1-yl)-2-fenilacetonitrile (77a): White solid. m.p. 105-112 °C. [α]D 20 = +21.39 (c = 0.38, CHCl3). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.55-1.79 (m, 2 H, CH2CH2CH2), 1.84-1.91 (m, 1 H, CH2CHHCHC(Ph)2OH), 2.04-2.14 (m, 1 H,
CH2CHHCHC(Ph)2OH), 2.67-2.76 (m, 2 H, CH2CH2N), 4.03 (s, 1 H, CHCN), 4.15 (bs, 1H, OH),
4.33 (dd, J = 4.4, 9.2 Hz, 1 H, CHHCHC(Ph)2OH), 7.17''7.23 (m, 3 H, ArH), 7.29-7.38 (m, 8 H,
ArH) 7.60-7.62 (m, 2 H, ArH), 7.78-7.80 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 23.8, 29.4, 50.7, 59.1, 68.9, 78.2, 116.6, 125.2, 125.4, 126.7, 127.1, 127.4, 128.3, 128.7,
128.8, 128.9, 133.9, 145.5, 147.1 ppm. IR: ν' = 3500, 2970, 1682, 1596 cm ''1. C25H24N2O (368.47): calcd. C 81.49, H 6.57, N 7.60; found C 81.62, H 6.68, N 7.51 HPLC-MS: Rt = 12.07 min, m/z = 342 [M
'' CN] +, 369 [M + H]+, 391 [M + Na]+.
(S)-2-((S)-2-(idrossidifenilmetil)pyrrolidin-1-yl)pentanenitrile (78a): White solid; m.p. 107-114 °C. [α]D 20 = -36.21 (c = 0.62, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.66 (t, J = 6.8, 1 H, CH3CH2CH2), 1.06-1.16 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.37-1.46 (m, 1 H,
CH3CH2CHH), 1.48-1.58 (m, 1 H, CH3CH2CHH), 1.73-1.84 (m, 3 H, CHHCHHCHC(CPh2OH)), 1.93-
2.06 (m, 1 H, CH2CHHCH(CPh2OH)), 2.71-2.79 (m, 2H, CHCN + CH2CHHN), 3.09-3.14 (m, 1 H,
CH2CHHN), 3.96 (bs, 1 H, OH), 4.10 (dd, J = 3.6, 9.2 Hz, CH(CPh2OH), 7.16''7.21 (m, 2 H, ArH),
7.27-7.34 (m, 4 H, ArH) 7.53-7.56 (m, 2 H, ArH), 7.61-7.63 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.0, 18.9, 24.0, 28.9, 34.5, 50.1, 54.7, 69.6, 77.9, 118.4, 125.1, 125.4, 126.5, 126.8, 128.1,
128.5, 145.4, 147.1. IR: ν' = 3411, 3066, 3023, 2923, 2224, 1141 cm ''1.C22H26N2O (334.45): calcd. C 79.00, H 7.84, N 8.38; found C 79.28, H 7.92, N 8.44. HPLC-MS: Rt = 11.78 min, m/z = 308 [M '' CN] +, 335 [M + H]+.
Metil 1-(cyano(fenil)metil)-4-idrossipyrrolidine-2-carboxylate (79): Diastereoisomers separated by flash-chromatography. 79a
(2S,4R,1''S) major isomer: white solid; m.p. 88-92 °C; [α]D 20 = -74.20 (c = 1.5, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.77 (bs, 1 H, OH), 2.23-2.27 (m, 2 H, CH2CHCO2Me), 2.57 (dd, J = 4.0, 10.4 Hz, 1 H,
CHCHHN), 3.08 (dd, J = 5.2, 10.4 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.80 (s, 3 H, CH3), 3.92 (dd, J = 7.6, 8.8 Hz, 1 H, CHHCHCO2Me), 4.37-4.42 (m, 1 H, CHOH), 5.38 (s, 1 H, CHCN), 7.37-7.43
(m, 3 H, ArH), 7.57-7.59 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 38.7, 52.2, 56.7, 57.9, 61.6, 69.2, 116.2, 127.5, 128.8, 128.9, 133.5, 172.8 ppm. IR: ν' = 3178, 2227, 1740, 1207 cm ''1. C14H16N2O3 (260.29): calcd. C 64.60, H 6.20, N 10.76; found C 65.02, H 6.18, N 10.68. HPLC-MS: Rt = 5.41 min, m/z = 234 [M - CN] +, 261 [M + H] +, 283 [M + Na]+. 79b (2S,4R,1''R) minor isomer: white solid; m.p. 103-104 °C; [α]D20 = -13.10 (c = 1.5, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.99 (bs, 1 H, OH), 2.11 (dddd, J = 0.8, 4.8, 8.4, 9.2 Hz 1 H, CHCHHCHCO2Me), 2.18-2.25 (m, 1H, CHCHHCHCO2Me), 2.89 (ddd, J = 0.8, 4.0, 9.6 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.38 (s,
3 H, CH3), 3.55 (dd, J = 4.8, 9.6 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.75 (dd, J = 6.4, 8.4 H, 1 H, CHHCHCO2Me), 4.55-4.60 (m, 1
H, CHOH), 5.16 (s, 1 H, CHCN), 7.37-7.41 (m, 3 H, ArH), 7.47-7.50 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 39.4, 51.7, 57.9, 59.6, 60.6, 69.8, 116.6, 128.3, 128.7, 129.2, 132.4, 173.2 ppm. IR: ν' = 3377,
2943, 2230, 1739, 1207 cm ''1. C14H16N2O3 (260.29): calcd. C 64.60, H 6.20, N 10.76; found C 64.81, H 6.29, N 10.64. HPLC-MS: Rt = 3.99 min, m/z = 234 [M - CN] +, 261 [M + H]+, 283 [M + Na]+, 543 [2M + Na+].
Metil 1-(1-cyanobutyl)-4-idrossipyrrolidine-2-carboxylate (80): Diastereoisomers separated by flash-chromatography. 80a
(2S,4R,1''S) major isomer: pale yellow oil; [α]D 20 = -103.90 (c = 0.6, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.97 (t, J = 7.6 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.48-1.60 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.73-1.79 (m, 3 H,
CH3CH2CH2, OH), 2.12-2.24 (m, 2 H, CH2CHCO2Me), 2.63 (dd, J = 3.6, 10.4, 1 H, CHHCHHN), 3.43 (dd, J = 5.2, 10.4, 1 H, CHHCHHN), 3.73-3.78 (m, 1 H, CHHCHCO2Me), 3.75 (s, 3 H,
CH3), 3.99 (t, J = 7.6 Hz, 1 H, CHHCHCN), 4.45-4.51 (m, 1 H, CHOH) ppm. 13C NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 12.9, N Pr CN N Pr CN OH OH N Ph CN OH Ph Ph N Pr CN OH Ph Ph N COOMe Ph CN N COOMe Ph CN HO HO N COOMe Pr CN N COOMe Pr CN HO HO 18.7, 34.0, 38.1, 51.8, 53.5, 56.0, 61.7, 68.6, 117.5, 172.7 ppm. IR: ν' = 3450, 2959,2874, 2226, 1743, 1438,
1090 cm ''1. C11H18N2O3 (226.27): calcd. C 58.39, H 8.02, N 12.38; found C 58.48, H 8.11, N 12.21. HPLC-MS: Rt = 3.99 min, m/z = 200 [M - CN] +, 227 [M + H]+, 249 [M + Na]+. 80b (2S,4R,1''R) minor isomer: 0.94 (t, J = 7.2 Hz, 1 H, CH3CH2CH2), 1.42-1.57 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.59-1.72 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.87 (bs, 1 H, OH), 2.14
(dddd, J = 0.8, 5.6, 8.4, 14.0 Hz, 1 H, CHCHHCHCO2Me), 2.22-2.28 (m, 1 H, CHCHHCHCO2Me), 2.82 (ddd, J =
0.8, 4.4, 10.0 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.42 (dd, J = 5.6, 10 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.75 (s, 3 H, CH3), 3.76-3.82 (m, 2 H,
CHCO2Me + CHCN), 4.52-4.58 (m, 1 H, CH2CH(OH)CH2). HPLC-MS: Rt = 3.31 min, m/z = 200 [M - CN] +, 227 [M + H] +, 249 [M + Na]+.
2-(4-idrossi-2-(idrossimetil)pyrrolidin-1-yl)-2-fenilacetonitrile (81): 81a (2S, 4R, 1''S, major) Obtained pure e characterized after
spontaneous isomerization of a 81a/81b mixture. Pale yellow solid;
m.p. 105.2-107.1 °C; [α]D 20 = -110.91 (c = 0.66, MeOH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.95 (ddd, J = 4.4, 8.0 e 13.0 Hz, 1 H, CHCHHCH),
1.92-2.11 (bs, 2H, OH), 2.06 (ddd, J = 6.8, 8.4 e 13.0 Hz, 1 H, CHCHHCH), 2.59 (dd, J = 4. 8, 10.0 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.01 (dd, J = 6.0, 10.0 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.39-3.45 (m,
1 H, CHHCHCH2OH), 3.62 (dd, J = 4.0, 12.0 Hz, 1 H, CHCHHOH), 3.85 (dd, J = 3.2, 12.0 Hz, 1 H, CHCHHOH),
4.31-4.36 (m, 1 H, CHOH), 5.32 (s, 1 H, CHCN), 7.37-7.42 (m, 3 H, ArH), 7.48-7.51 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 37.1, 57.4, 57.7, 61.5, 62.7, 69.4, 116.4, 127.4, 128.9 (2xC), 133.7 ppm. IR (nujol): ν' = 3334, 2229 cm ''1.C13H16N2O2 (232.28): calcd. C 67.22, H 6.94, N 12.06; found C 66.89, H 6.98, N 11.99. HPLC- MS: Rt = 2.49 min (major + minor), m/z = 206 [M - CN] +, 233 [M + H]+, 255 [M + Na]+, 487 [2M + Na]+. 81b (2S, 4R, 1''R) minor isomer: obtained only as a diastereomeric mixture, only main signals are reported 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.85 (dd, J = 5.2, 11.6 Hz, 1 H, CHCHHOH), 4.40-4.50 (m, 1 H, CHOH), 5.16 (s, 1 H,
CHCN) ppm. Product 81a was also obtained starting from 79a through reduction of ester function con NaBH4
(see electronic supplementary information for details)

2-(4-idrossi-2-(idrossimetil)pyrrolidin-1-yl)pentanenitrile (82): Characterized as diastereomeric mixture, signals refer to major
diastereosiomer, only main signals of minor one are reported. 82a
(2S,4R, 2''S) major isomer + 82b (2S, 4R, 2''S) minor isomer. pale
yellow oil; H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 0.98 (t, J = 7.6 Hz, 3 H, CH3CH2CH2, minor) 1.45-1.68 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.66-1.79 (m, 2 H, CH3CH2CH2), 1.89 (ddd, J = 4.0, 7.6 e 13.0 Hz, 1 H, CHCHHCH), 1.96-2.07
(m, 1 H, CHCHHCH), 2.63 (dd, J = 4.0, 9.6 Hz, 1 H, CHCHHN), 2.77 (dd, J = 5.6, 9.6 Hz, 1 H, CHCHHN, minor),
3.20-3.26 (m, 1 H, CHCHCH2OH), 3.34 (dd, J = 5.6, 10.0 Hz, 1 H, CHCHHN), 3.48 (dd, J = 3.2, 12.0 Hz, 1 H,
CHCHHOH), 3.55-3.59 (m, 1H, , CHCHHOH minor), 3.68 (dd, J = 3.2, 12.0 Hz, 1 H, CHCHHOH), 3.77 (dd, J = 6.4,
10.0 Hz, 1H, CHCN, minor), 3.87 (t, J = 8.0 Hz, 1 H, CHCN), 4.40 (m, 1 H, CHOH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 13.3, 19.2, 34.6, 36.9, 53.2, 57.0, 61.5, 61.7, 69.7, 118.1 ppm. IR: ν' = 3406, 2961, 2874, 2226,
1097 cm ''1. HPLC-MS: Rt = 1.79 min (major + minor) m/z =172 [M - CN]+, 199 [M + 1]+, 221 [M + Na]+. Product 82a was also obtained starting from 75a through reduction of ester function con NaBH4 (see
electronic supplementary information for details)

(2S,4S)-metil-1-((S)-cyano(fenil)metil)-4-iodopyrrolidine-2-carboxylate (83a): To a stirred solution of 79a (134 mg, 0.51 mmol) e trifenil phosphine (161 mg, 0.61
mmol) in 1.5 mL of THF at 0 oC a 40% solution of DEAD in toluene (107 mg, 0.61 mmol) was added dropwise followed by addition of metil iodide (38 µL, 0.61 mmol). After 20
min, the solution was allowed to warm to room temperature e stirred for 5 h until
completion (TLC control). The reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure e the residue was purified by flash chromatography obtaining 83a (153 mg, 0.41 mmol) in
81% yield as a white solid. M.p. 80-85 ° C; [α]D 20 = -28.55 (c = 0.20, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 2.66 (ddd, J = 6.0, 6.4, 14.4 Hz, 1 H, CHICHHCHCO2Me), 2.91 (ddd, J = 6.8, 9.2, 14.4 Hz, 1 H, CHICHHCHCO2Me),
2.99 (dd, J = 4.0, 11.2 Hz, 1 H, NCHHCHI), 3.05 (dd, J = 6.0, 11.2 Hz, 1 H, NCHHCHI), 3.76 (dd, J = 6.8, 8.8 Hz,
CH2CHCO2Me), 3.84 (s, 3 H, CH3), 4.32 (m, 1 H, CHI), 5.49 (s, 1 H, CHCN), 7.37-7.46 (m, 3 H, ArH), 7.64-7.66
(m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 15.3, 41.8, 52.5, 57.8, 59.1, 62.2, 116.4, 127.3, 128.9, 129.0, 133.2, 171.8 ppm. IR: ν' = 3028, 2950, 2230, 1746, 1493, 1130 cm ''1. C14H15IN2O2 (370.19): calcd. C 45.52, H 4.08, N 7.57; found C 45.62, H 4.11, N 7.42. HPLC-MS, Rt = 9.93 min, m/z 371 [M + H] +, 393 [M + Na] +.
((S)-1-((S)-2-ammino-1-feniletil)pyrrolidin-2-yl)methanol (84a): To a stirred solution of cyano ester 70a (0.2 mmol) in THF (1.7 mL) at 0° under inert N Ph CN N Ph CN HO HO OH OH N Pr CN N Pr CN HO HO OH OH N COOMe Pr CN I N Ph NH2 OH atmosphere a solution of 2 M LiAlH4 (500 µL) dropwise. After 15 minutes, the solution was allowed to warm
to room temperature. The reaction course was monitored by TLC e at completion after 4 hours a saturated
solution of Na-K tartrate salt was added con vigorous stirring to favor phase separation. The separated
organic phases were dried on Na2SO4, concentrated e purified by flash chromatography (eluent
CHCl3/MeOH/NH4OH 60/30/1) to yield product 84a in 39% yield. [α]D 20 = +1.68 (c = 0.31, CH2Cl2); 1H NMR (D2O, 400MHz): δ 1.62-1.71 (m, 2H, NCH2CH2CH2), 1.78-1.87 (m, 2H, NCH2CH2CH2), 2.66 (m, 1H,
NCHHCH2CH2), 2.91 (m, 1H, NCHHCH2CH2), 3.02 (m, 2H, CH2NH2), 3.15 (m, 2H, CHN + CH2OH), 3.35 (dd, J = 4.4Hz, 12.4Hz; 1H, CH2OH), 3.74 (dd, J = 4.8Hz, 10.8Hz, 1H, PhCHN), 7.40-7.53 (m, 5H, Ph). 13C NMR (D2O, 50.3MHz): δ 24.4, 28.7, 43.6, 52.9, 60.6, 64.9, 68.0, 127.7, 127.9, 128.3, 128.6, 128.8, 139.2; IR (neat, ν' =
3358, 2924, 1599, 1493, 1453, 1379, 1074, 1040, 766, 735, 704. cm ''1. HPLC-MS: m/z (tr = 1.26 min; 221 [M + H] +.
((S)-1-((S)-1-amminopentan-2-yl)pyrrolidin-2-yl)methanol (85a): Same procedure as above starting from 71a. Yield 36%. orange oil; [α]D 20 = +68.0 (c = 1.50, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 0.93 (t, J = 6.4 Hz, 3 H, CH3CH2CH2), 1.31-1.46 (m, 4 H, CH3CH2CH2), 1.63-1.82 (m, 4 H, NCH2CH2CH2), 2.61-2.82 (m, 4 H,CHCH2NH2 + N CH2CH2CH2),
2.97-3.13 (m, 5 H, NCHCH2NH2 + CH2CHCH2OH + OH + NH2), 3.30 (dd, J = 4.8, 10.8 Hz, 1 H,
CHHOH), 3.48 (dd, J = 3.6, 10.8 Hz, 1 H, CHHOH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 14.3, 20.4, 24.5, 29.0, 31.7, 42.4, 50.0, 58.8, 60.9, 64.4 ppm. IR: ν' = 3280, 2957, 2927, 2870, 1660, 1106 cm ''1. C10H22N2O (186.29): calcd. C 64.47, H 11.90, N 15.04; found C 64.58, H 11.99, N 14.78.

2-Carboxy-1-(carboxy(fenil)metil)pyrrolidin-1-ium hydrogen chloride (86): A solution of 70a (2.75 mmol, 670 mg) in HCl 37% (12 mL) was refluxed
for 24 h e after completion the water was removed. The crude was
washed con CH2Cl2 to obtain 86 as a mixture of diastereoisomers in 88%
yield (de 78/22).
Characterized as diastereomeric mixture. Signals refer to major diastereosiomer, only main signals of the minor one are reported. White solid. 86a (2S, S) major isomer +
86b (2S, R) minor isomer): 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 2.02-2.31 (m, 3 H, CH2CH2CH2 + CH2CHHCHCO2H), 2.39-2.46 (m, 1 H, CH2CHHCHCO2H), 2.54-2.64 (m, 1 H, CH2CHHCHCO2H, minor), 3.36-3.46 (m, 1 H, NCHHCH2,
minor), 3.56-3.62 (m, 1 H, NCHHCH2), 3.59-3.67 (m, 1 H, CH2CHHN, minor), 3.95-4.01 (m, 1 H, NCHHCH2), 4.39-4.43 (m, 1 H, CH2CHCO2H, minor), 4.49 (dd, J = 6.4, 9.2 Hz, 1 H, CH2CHCO2H), 5.45 (s, 1H, PhCH), 5.55 (s,
1H, PhCH, minor), 7.51-7.62 (m, 5H, Ph). 53a, 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ = 25.2, 31.4, 57.9, 67.7, 72.3, 131.3, 131.5, 132.2, 132.9, 170.7, 171.8 ppm. HPLC-MS: Rt = 1.48 min, m/z = 250.

(S)-metil-1-((S)-2-ammino-2-oxo-1-feniletil)pyrrolidine-2-carboxylate (87a): In a 5 mL vial equipped con a screw crap the metilester 70a (1.64 mmol, 400 mg) was
additioned con acetic acid (9.84 mmol, 637 µL), water (6.56 mmol, 118 µL), TiCl4 (3.28
mmol, 360 µL) e CH2Cl2 (1 mL) in this order. The solution was stirred overnight on an
orbital shaker e the reaction was monitored by TLC. When the reaction was complete,
CH2Cl2 was added e the organic phase was separated e discharged. The aqueous solution was treated con saturated NaHCO3 till basic pH e then extracted 3 times con CH2Cl2. The collected organic
phases were dried over Na2SO4 e concentrated in vacuo to afford 87a in quantitative yield. White solid m.p. 149.2-153.9°C; [α]D 20 = +2.83 (c = 1.20, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.81-1.96 (m, 3 H, CH2CH2CH2 + CH2CHHCHCO2Me), 2.00-2.08 (m, 1 H,CH2CHHCHCO2Me), 2.71-2.77 (m, 1 H, CH2CHHN), 3.27-3.32 (m, 1 H,
CH2CHHN), 3.36 (dd, J = 4.0, 9.6 Hz, 1 H, CH2CHCO2Me), 3.50 (s, 3 H, CH3), 4.24 (s, 1H, PhCHCONH2), 5.73 (bs,
1H, CONHH), 7.29-7.33 (m, 5 H, ArH), 7.66 (br. s, 1 H, CONHH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 24.2, 30.6, 51.7, 54.4, 61.7, 73.2, 128.5, 128.6, 129.2, 136.5, 174.8, 175.9 ppm. IR: ν' = 3397, 2919, 1725, 1667,
1129 cm ''1. C14H18N2O3 (262.30): calcd. C 64.10, H 6.92, N 10.68; found C 63.99, H 6.94, N 10.72. HPLC-MS: Rt = 3.41 min, m/z = 263 [M + H] +, 285 [M + Na]+, 547 [2M + Na]+.
(4S
,7R,8aS)-7-idrossi-4-feniltetrahydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]oxazin-3(4H)-one (88a). The product was obtained in 40% yield after flash chromatography con the same
procedure reported for the obtainment of amide 87a starting from amminol 81a. Pale
yellow oil: [α]D 20 = -2.47 (c = 0.15, CHCl3), 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 1.92 (ddd, J = 4.8, 9.6, 14.0 Hz, 1 H, CHOHCHHCH), 2.09-2.17 (m, 1 H, CHOHCHHCH), 2.91 (dd, J = 3.6, 10.0
Hz, 1 H, NCHHCHOH), 3.12-1.15 (d, J = 10.0 Hz, 1 H, NCHHCHOH), 3.84-3.92 (m, 1 H, CH2CHCH2OCO), 4.14 (dd, J = 4.8, 11.6 Hz CHCHHOCO), 4.17 (dd, J = 4.4, 11.6 Hz, CHCHHOCO), 4.49-4.51 (m,
1 H, CH2CHOHCH2), 4.60 (s, 1 H, CHPh), 7.37-7.40 (m, 3 H, ArH), 7.64-7.66 (m, 2 H, ArH) ppm. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ = 37.6, 52.9, 62.2, 65.8, 68.4, 71.3, 127.1, 128.2, 128.7, 135.5, 170.9 ppm. IR: ν' = 3362, 2924, N Pr NH2 OH N COOH Ph COOH N COOH Ph COOH H H Cl Cl N COOMe Ph CONH2 N HO O Ph O 2853, 1737, 1042 cm ''1. C13H15NO3 (233.26): calcd. C 66.94, H 6.48, N 6.00; found C 66.88, H 6.53, N 6.09. HPLC-MS, Rt = 2.44 min, m/z = 234 [M + H] +, 256 [M + Na]+, 272 [M + K]+, 489 [2M + Na]+.
Correlazione chimica
Chemical shift protoni in alfa ai nitrili
Chemical shift of the proton on the carbon α to the CN group and HPLC retention times of major and minor isomer of
products 46-62 and 70-82. Product α -R 1CHCN (ppm) major isomer (a) α -R 1CHCN (ppm) minor isomer (b) HPLC Rt (min) major isomer (a) HPLC Rt (min) minor isomer (b) 46 4.42 4.77 9.95 9.66 47 3.18 3.74 8.12 8.89 48 2.83 3.32 10.76 10.55 49 3.00 3.45 9.64 9.31 50 4.50 4.71 7.46 8.01 51 3.30 3.88 7.35 6.51 52 3.08 3.44 - - 53 4.49 4.71 10.19 9.68 54 3.25 3.76 9.62 9.13 55 4.77 4.87 9.00 8.83 56 3.25 3.73 8.62 8.32 57 4.58 4.88 - - 58 3.27 3.73 9.16 8.90 59 3.30 3.47 7.22 6.87 60 3.46-3.53 3.46-3.53 7.66 7.35 61 4.60 4.80 - - 62 3.41 3.66 8.78 8.63 70 5.37 5.17 8.37 7.27 71 3.97 3.80 7.49 6.92 72 5.39 5.16 10.88 10.09 73 3.99 3.78 10.26 9.68 74 5.35 5.17 10.86 9.98 75 5.27 5.11 6.38 5.36 76 3.83 3.72 - - 77 4.03 - 12.07 - 78 2.71 - 11.78 - 79 5.38 5.16 5.41 3.99 80 3.99 3.76 3.99 3.31 81 5.32 5.16 - - 82 3.87 3.77 - -





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